miRNA-26b/PTEN/TDP-43信号通路在视网膜母细胞瘤Y79细胞株增殖中的作用研究

戴汉军

视网膜母细胞瘤(Retinoblastoma,RB)是1类多发于婴幼儿时期的眼内恶性肿瘤[1]。MicroRNA是非编码小RNA(21～23个核苷酸)，可调节许多生物学过程，其主要表现为在转录后水平调节基因表达[2]。TAR DNA结合蛋白43(TDP-43)是1种肌萎缩侧索硬化症相关蛋白，研究表明，TDP-43的降解可能是导致肌萎缩侧索硬化症的原因[3]；于此同时，TDP-43在癌症发生中也起着至关重要的作用[4]。第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白的同源基因(gene of phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN)是1种抑癌基因；PTEN的突变可导致多种肿瘤的发生[5]。在细胞生长信号中PTEN起着至关重要的作用，其作用机制主要涉及PI3K信号途径、FAK信号途径、MAPK信号途径[6-8]。本研究在视网膜母细胞瘤Y79细胞中，通过调节miRNA-26b调节PTEN/TDP-43信号通路，进而调节Y79细胞的增殖。

1 材料与方法

1.1 细胞株及其培养

人视网膜母细胞瘤Y79细胞株购自中国科学院细胞库。将Y79细胞接种于含10%胎牛血清的DMEM培养基中(每ml含青霉素和链霉素个100 U)，置于37 ℃、体积分数为5% CO2、饱和湿度培养箱中培养。

1.2 材料和处理

MiRNA-26b激活剂(agomir)、激活剂阴性对照(agomir control)、抑制剂(antagomir)和抑制剂阴性对照(antagomir control)购置于锐博生物(中国)，播种细胞时即刻处理。

pcDNA 3.1/hygro(+)、pcDNA 3.1/hygro(+) PTEN由中美泰和公司合成；NsiRNA、siRNATDP-43购自吉凯基因。当细胞密度长到60%～70%时，进行转染,处理NsiRNA、siRNATDP-43、EV、或PTEN-cDNA 8 h后换液，总体24小时后收取细胞。

1.3 Q-PCR

定量miRNA的测定。将2 μg RNA模板和500 nM RT引物(2 μl)加入无RNA酶的水中至11 μl体积，在70 ℃(10min)然后在冰上(2min)温育， 然后将5×RT缓冲液(5 μl)，2.5 mM dNTP Mix(2 μl)，100U RT酶(1 μl)加入无RNA酶的水中至25 μl的体积。 逆转录反应在42 ℃(60 min)然后在70 ℃(10 min)下孵育。 MiRNA qPCR反应由SYBR Green qPCR Master混合物(10 μl)，cDNA模板(2 μl)，5 μm Bulge-Loop miRNA正向引物(0.8 μl)和5 μm Bulge-Loop miRNA反向引物(0.8 μl)组成 倒入无RNA酶的水中至20 μl的体积。 将反应物在95 ℃(20 s)温育，接着在95 ℃(10 s)，60 ℃(20 s)和70 ℃(10 s)下进行40个循环，然后进行解链曲线分析。

1.4 免疫印迹

10% SDS-PAGE分离胶电泳，转膜，5%脱脂牛奶封闭1 h，加一抗4 ℃孵育过夜。TBST洗3次后，加入相应的二抗室温孵育1 h，TBST漂洗后加入ECL显色液，荧光成像仪成像。蛋白检测所用一抗：anti-TDP-43(Rabbit,1∶3000,三鹰生物)，anti-PTEN(Rabit,1∶1000,Cell signaling technology)。

1.5 细胞计数

采用细胞计数板统计细胞的数量。用无水乙醇擦拭细胞计数板，进而用丝布将计数盘和盖玻片擦试干净，将盖玻片盖在细胞计数板的顶部。以1∶1的比例将0.4%台盼蓝染料溶液移入细胞悬液中，充分混匀，将混合液从挤塑板边缘慢慢滴下，使液体充满计数区，勿产生气泡。稍等片刻，在低倍下(10×10倍)观察计数板四个大方格(每个大方格分成16个小方格)内的细胞总数。对于压线细胞只计算压上线和压左线的，进行两次。两次计数误差不应超过±5%。镜下观察：有强烈的折射的、透亮的而不染色的为活细胞，染上蓝色的为死细胞。计数完成后，计算每毫升悬浮液中细胞的数量。细胞数量计算公式如下：细胞悬液细胞数/ml=4个大方格细胞总数×2/4×10 000。

1.6 统计学方法

数据以平均值±标准差表示，应用SPSS 17.0进行统计学分析，单因素方差分析进行组间比较，P<0.05差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 抑制miRNA-26b可抑制Y79细胞增殖

Y79细胞接种于6 cm的培养皿后(初始密度：1.0×105±0.2×105个/ml)，处理miRNA-26b抑制剂(1 μM)，3 h后收取细胞。Q-PCR结果显示，处理miRNA-26b抑制剂后miRNA-26b水平显著下调(图1A)。与此同时，我们在处理miRNA-26b抑制剂后0 h、12 h、24 h测定Y79细胞的密度，我们发现抑制miRNA-26b后，细胞生长速度显著减缓(图1B～D)。进一步我们在Y79细胞上处理miRNA-26b激活剂(图1E)，我们发现Y79细胞生长速度显著加快(图1F～H)。这个记过显示抑制miRNA-26b可抑制Y79细胞的生长。

2.2 抑制miRNA-26b可下调TDP-43水平

研究表明，TDP-43在细胞生长中起着至关重要的作用[4]。Western blot检测miRNA-26b抑制剂处理24 h后的Y79细胞中的TDP-43水平，结果显示抑制miRNA-26b可下调Y79细胞中的TDP-43水平(图2A)。进一步确定TDP-43在Y79细胞中的作用，我们通过转染siRNATDP-43下调Y79细胞中的TDP-43水平(图2B)；与此同时，我们在处理siRNATDP-43后8 h收取细胞重新播种，并在播种后0 h、12 h、24 h测定Y79细胞的密度，我们发现抑制下调TDP-43后，细胞生长速度显著减缓(图2C～E)。

A为Q-PCR检测Y79细胞在处理miRNA-26b抑制剂后的miRNA-26水平；B-D为细胞计数测定处理miRNA-26抑制剂后0 h(B)，12 h(C)，24 h(D) 时Y79细胞的密度；E为Q-PCR检测Y79细胞在处理miRNA-26b激活剂后的miRNA-26的水平；F-H为细胞计数测定处理miRNA-26抑制剂后0 h(F)，12 h(G)，24 h(H) 时Y79细胞的密度。图1 抑制miRNA-26b可抑制Y79细胞的生长

A为Western blot检测Y79细胞在处理miRNA-26b抑制剂后的TDP-43水平；B为Western blot检测Y79细胞在抑制TDP-43后的TDP-43水平；C-E为细胞计数测定抑制TDP-43后0 h(C)，12 h(D)，24 h(E) 时Y79细胞的密度。图2 抑制miRNA-26b可下调TDP-43水平

2.3 抑制miRNA-26b可上调PTEN水平

PTEN为1种抑癌基因，与肿瘤发生密切相关[5]。Western blot检测miRNA-26b抑制剂处理24 h后的Y79细胞中的PTEN水平，结果显示抑制miRNA-26b可上调Y79细胞中的PTEN水平(图3A)。进一步确定PTEN在Y79细胞中的作用，我们通过在Y79细胞中过表达PTEN(图3B)；与此同时，我们在转染后8 h收取细胞重新播种，并在播种后0 h、12 h、24 h测定Y79细胞的密度，我们发现过表达PTEN后，细胞生长速度显著减缓(图3C～E)。

A为Western blot检测Y79细胞在处理miRNA-26b抑制剂后的PTEN水平；B为Western blot检测Y79细胞在过表达PTEN后的PTEN水平；C-E为细胞计数测定过表达PTEN后0 h(C)，12 h(D)，24 h(E) 时Y79细胞的密度。图3 抑制miRNA-26b可上调PTEN水平

2.4 MiRNA-26b调节的Y79细胞生长由PTEN/TDP-43介导

在抑制TDP-43或上调PTEN的情况下再处理miRNA-26b抑制剂，结果显示Y79细胞在处理miRNA-26b抑制剂后与未处理组对比，细胞生长速度无显著差异。这个结果揭示TDP-43和PTEN介导miRNA-26b调节的细胞生长作用。此外，Western blot检测过表达PTEN后的TDP-43水平，显示TDP-43显著下调；Western blot检测抑制TDP-43后的PTEN水平，结果显示无显著差异。进一步，Western blot检测过表达PTEN后进一步处理miRNA-26b抑制剂后的TDP-43水平，显示无显著差异。这个结果表明MiRNA-26b调节的Y79细胞生长由PTEN/TDP-43介导。

3 讨论

近年来miRNA与视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,RB)的关系已被广泛关注[9-10]。不同的miRNA在不同的肿瘤组织中具有一定的特异性表达，既可表现出癌基因作用，也可有抑癌基因作用。有研究报道，miRNA-26b在乳腺癌发生中起着至关重要的作用[11]，但在视网膜母细胞瘤中的作用上不确定。本研究揭示，抑制miRNA-26b可抑制Y79细胞的增殖，且这个过程由上调PTEN反向调节TDP-43水平介导。

Y79细胞系是第1个培养成功的人视网膜细胞瘤细胞系，来源于1位2岁半白种女性RB患儿[12]。当我们在Y79细胞中抑制miRNA-26b后，显著观察到Y79细胞生长减慢；与此同时，激活miRNA-26b得到了相反的结果。这个结果表明，miRNA-26b可正向调节Y79细胞的生长。与miRNA-26b在乳腺癌正的促癌作用相吻合[11]，但是调节细胞生长得作用机制尚不明确。我们发现，在抑制miRNA-26b后，Y79细胞内TDP-43水平显著下调。研究表明，TDP-43与肿瘤生长气息相关。我们进一步证实，下调TDP-43的情况下，可抑制Y79细胞的生长。研究表明，miRNA-26b在巨噬细胞中可负向调节PTEN的表达[13]。我们发现，当抑制miRNA-26b的情况下，Y79细胞中的PTEN水平显著上调。PTEN是1种抑癌基因，上调PTEN可抑制肿瘤细胞的增殖。

进一步探索miRNA-26b调节的Y79细胞增长是否与TDP-43或PTEN直接相关。我们在抑制TDP-43或过表达PTEN的情况下，进一步处理miRNA-26b抑制剂，Y79细胞的生长状况未发现显著差异。这个结果证实，miRNA-26b介导的Y79细胞的生长作用于TDP-43和PTEN直接介导。有研究表明，在缺血性脑损伤后，PTEN可负向调节TDP-43发挥神经保护作用[14]。我们猜测，在Y79细胞中是否PTEN与TDP-43存在相似的关系。我们揭示，在Y79细胞中PTEN可负向调节TDP-43表达。并进一步揭示，miRNA-26b调节的TDP-43水平变化由PTEN介导。这个结果说明，miRNA-26b介导的Y79细胞生长作用，是通过PTEN调节TDP-43介导。

总而言之，我们揭示，在人视网膜母细胞瘤Y79细胞中，抑制miRNA-26b可抑制细胞的生长；且这个过程是由抑制miRNA-26b导致PTEN上调，进一步引起TDP-43下调介导。miRNA-26b调节的PTEN /TDP-43变化可能成为治疗视网膜母细胞瘤的潜在靶点。