神香草挥发油对急性炎症的作用*

谷会青，张洪平，侯亚申，伊合帕尔·吐依洪

(1.新疆医科大学第四临床医学院，乌鲁木齐 830011；2.新疆医科大学附属中医医院呼吸病研究重点实验室，乌鲁木齐 830000)

1 材料与方法

1.1药品与试剂 神香草于2014年7月采自新疆维吾尔自治区阿勒泰市小东沟，经新疆维吾尔自治区中医医院药学部赵翡翠主任中药师鉴定为硬尖神香草(HyssopuscuspidatusBoriss)的全草。阿司匹林肠溶片(Bayer Health Care Manufacturing S.r.l，批号：BJ32094)，MDA试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20170418)，二甲苯(天津市百世化工有限公司，批号：20160412)，N-萘乙胺盐酸盐[西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，批号：N9125-10G]，无水对氨基苯磺酸[西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，批号：SLBC0284V]，青霉素钠(北京悦康凯悦制药有限公司，批号：06160116)，氢氧化钾(天津市大茂化学试剂厂，批号：20091017)，甲醇(天津市百世化工有限公司，批号：20161202)。

1.2实验动物 昆明种小鼠50只，体质量 18～22 g，雌雄各半，清洁级，购于新疆维吾尔自治区疾病控制中心，动物使用许可证号：SYXK(新)2016-002；实验动物合格证号：65000200001137。动物饲养于温度(23±2)℃、相对湿度60%～65%、12 h明暗交替环境，分笼饲养，标准饲料，自由进食饮水。

1.3HEO的制备 参考文献[12]，采用干燥的神香草，全草切成细段，按《中华人民共和国药典》(第四部，2015年版)2204项下挥发油测定法甲提取挥发油，称取药材，收集挥发油用无水硫酸钠除水，挥发油得率为0.18%，放在干燥遮光玻璃瓶里用封口膜密封，4 ℃保存。

1.4HEO对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响 昆明种小鼠按照随机数字表法分成4组：模型对照组 (0.9%氯化钠溶液)、阿司匹林组 (200 mg·kg-1)、HEO大剂量组(0.4 mL·kg-1)、HEO小剂量组(0.2 mL·kg-1)，每组10只；灌胃给药 每天1次，连续 7 d，灌胃体积均为0.02 mL·g-1，末次给药后 30 min，各组小鼠均在小鼠右耳前、后面均匀涂二甲苯50 μL致炎，1 h后取血，将收集血液放在EP管中3500 r·min-1离心10 min(r=15 cm)，将上清液转移到另一个EP管放在-85 ℃冰箱备用。沿耳廓基线剪下两耳，用直径9 mm打孔器分别在两耳的同一部位打下圆耳片，精密称质量，以左、右耳质量差为肿胀度，以此判断HEO对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响；耳肿胀度 (mg)=右耳片质量-左耳片质量；肿胀抑制率 (%)= [(模型对照组平均肿胀度-给药组平均肿胀度)/模型对照组平均肿胀度]×100%[13]。

1.5硫代巴比妥酸(TBA)法对小鼠血清中MDA含量进行检测 将实验小鼠处死取血后，经离心机离心后得到血清样本。按照试剂盒说明书对各个试剂进行处理后得到试剂一、试剂二应用液、试剂三应用液，再按照操作步骤在空白管先后分别加入0.1 mL无水乙醇和试剂一、1.5 mL试剂二和试剂三应用液；在标准管中加入0.1 mL标准品(四乙氧基丙烷)代替空白管的无水乙醇，其他试剂与空白管相同；测定管中加入0.1 mL测试样品代替标准管中的标准品，其他试剂与标准管中的试剂相同。旋涡混匀后，用保鲜膜将试剂管扎紧再刺一小洞，95 ℃水浴40 min，用冷水冷却后3500 r·min-1离心10 min(r=15 cm)，取上清液约0.8 mL在532 nm处测吸光度(A值)。计算公式：血清中MDA含量(nmol·mL-1)=(测定A值-空白A值)/(标准A值-空白A值)×标准品浓度(10 nmol·mL-1)×样品稀释前的稀释倍数[14]。

1.6Griess法检测小鼠血清中NO含量 将实验小鼠处死取血后，经离心机离心后得到血清样本[15]。然后按照相关资料分别配制正确的试剂，10 mmol·mL-1亚硝酸钠标准液，试剂A(用85%浓磷酸0.6 mL、去离子水7 mL、与无水对氨基苯磺酸0.1 g进行混匀，最后定容至10 mL)试剂B(N-1-萘乙二胺盐0.01 g，酸盐用去离子水定容至10 mL)。按照操作步骤分别进行标准品浓度稀释(稀释浓度分别是6.250，3.125，1.560，0.780，0.390和0.295 μmol·mL-1)，加样，分别加入试剂A与试剂B，最后在540 nm波长检测A值。以标准浓度为横坐标，A值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品A值与标准物浓度求出直线回归方程，NaNO2含量计算公式X=0.932 3Y-0.535 4，R2=0.998 6。计算样品浓度，再乘以稀释倍数，即为实际样品浓度。

1.7紫外分光光度法检测小鼠血清中PGE2含量 将实验小鼠处死取血后，经离心机离心后得到血清样本。然后按照相关资料分别配制正确的试剂，0.5 mol·L-1氢氧化钾甲醇溶液。取小鼠血清0.5 mL，然后加入0.5 mol·L-1氢氧化钾甲醇溶液1 mL，混匀后50 ℃水浴异构化20 min，取出稍冷却后2000 r·min-1离心3 min(r=15 cm)，取上清液，紫外分光光度计278 nm处测定吸光度值[16]。由于小鼠灌胃操作失误及部分小鼠采血量较少造成样本量有所减少。

2 结果

2.1HEO对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响 致炎后各组小鼠右耳立刻出现明显红肿现象，阿司匹林组、HEO大剂量组与小剂量组与模型对照组比较都有很明显的抗炎作用，HEO大剂量组平均肿胀抑制率为57.96%；HEO在实验浓度范围内可明显降低二甲苯致小鼠的耳廓肿胀度 (P<0.01)。见图1。

A.模型对照组；B.阿司匹林组；C.HEO大剂量组；D.HEO小剂量组；与模型对照组比较，*1P<0.01。图1 4组小鼠耳肿胀度比较A.model control group ;B.aspirin group ;C.high-dose HEO group ;D.low-dose HEO group ;Compared with model control group，*1P<0.01.Fig.1 Comparison of ear swelling among four groups of

2.2HEO对二甲苯致小鼠耳肿胀急性炎症模型小鼠血清MDA含量的影响 与模型对照组比较，阿司匹林组和HEO大剂量组、小剂量组的MDA含量明显降低，药物处理组与模型对照组间的差异有统计学意义(P<0.01)，HEO大、小剂量组与阿司匹林组差异不明显(P>0.05)。HEO可降低急性炎症模型小鼠血清中的MDA含量，见图2。

2.4HEO对急性炎症模型大鼠血清PGE2含量的影响 与模型对照组比较，HEO大、小剂量组与阿司匹林组小鼠血清PGE2含量均明显降低(P<0.05)，见图4。

A.模型对照组；B.阿司匹林组；C.HEO大剂量组；D.HEO小剂量组；与模型对照组比较，*1P<0.01。图2 4组小鼠血清中MDA含量比较A.model control group ;B.aspirin group ;C.high-dose HEO group ;D.low-dose HEO group ;Compared with model control group，*1P<0.01.Fig.2 Comparison of serum MDA content among four groups of

A.模型对照组；B.阿司匹林组；C.HEO大剂量组；D.HEO小剂量组；与模型对照组比较，*1P<0.05。图3 4组小鼠血清中NO含量比较A.model control group ;B.aspirin group ;C.high-dose HEO group ;D.low-dose HEO group ;Compared with model control group，*1P<0.05.Fig.3 Comparison of serum NO content among four groups of

3 讨论

炎症是具有血管系统的组织对致炎因子的侵入所发生的防御反应，在一般的炎症反应过程中，由于炎症递质的刺激，血管通透性增加引起血管内容物渗入到组织间隙，以毛细血管扩张和通透性增高、渗出和组织肿胀主；随之白细胞从血液渗透到组织间隙，以白细胞聚集为主；最后是肉芽肿的形成、纤维组织增生等[17-19]。

本实验在前期HEO药效学研究的基础上[20]，通过急性炎症模型对HEO的抗炎效果做进一步的药理学研究。结果显示，HEO处理可抑制急性炎症小鼠耳肿胀。MDA是机体脂质过氧化反应中的代谢产物之一，其水平可反映机体的脂质过氧化程度，间接反映细胞的损伤情况[21]。本实验发现，HEO可降低耳肿胀小鼠血清MDA的含量，因此推测HEO对小鼠耳肿胀的抑制作用可能与降低小鼠血清MDA的含量，抑制氧化应激有关。

A.模型对照组；B.阿司匹林组；C.HEO大剂量组；D.HEO小剂量组；与模型对照组比较，*1P<0.05。图4 4组小鼠血清中PGE2含量比较A.model control group ;B.aspirin group ;C.high-dose HEO group ;D.low-dose HEO group ;Compared with model control group，*1P<0.05.Fig.4 Comparison of serum PGE2 content among four groups of

在炎症部位，NO作用于血管平滑肌细胞，升高其cGMP水平，使血管舒张，通透性增高，以利于炎症递质和致痛物质到达作用部位，在炎症反应中促进单核细胞向炎症部位渗入[22]。PGE2是一种重要的促炎症因子，是巨噬细胞产生的一种非蛋白、非多肽的脂肪酸代谢产物[23]。本实验发现，HEO可降低耳肿胀度，同时也可降低小鼠血清NO和PGE2的含量，由此推断HEO的抗炎作用可能与HEO降低组织内NO和PGE2的含量有关。

综上所述，HEO对二甲苯致急性炎症具有一定的抑制作用，其作用机制可能与降低NO和MDA含量，抑制炎症因子PGE2表达有关，但其作用机制还需进一步探讨。