藏鸡MyoG基因的表达及其与经济性状的相关分析

郭赛

（湖北师范大学 生命科学学院，湖北黄石 435002）

藏鸡多生长在低气压（57.7 kPa)、缺氧（氧分压为11.9 kPa）的恶劣环境下，因而生长缓慢，产蛋量较少。27.5%的氧浓度使得低海拔鸡品种在高海拔地区孵化率高达88.7%[1]，结合这一特点，我国引入大量品质优良、生长迅速的外国鸡种，与本土藏鸡进行杂交，培育出易于养殖、生长周期短的新藏鸡品种品系。

研究表明，MyoG基因位于MyoD和Myf5的下游，具有使生肌细胞向肌小管分化的独特功能[2]。MyoG与MRF4具有同源性，是控制肌肉分化且唯一在所有骨骼肌细胞系中均可表达的基因，是骨骼肌分化所必需的因子，通过控制肌细胞的融合和肌纤维的形成来对肌肉的形成起到关键作用[3-5]。本研究探讨藏鸡的MyoG（肌细胞生成素）在不同日龄、性别藏鸡的胸肌和腿肌的表达及其与经济性状的相关性，为藏鸡在保持原优良性状的基础上进一步培育与改良提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

本次实验所选取的藏鸡来自于中国四川省彭州市藏鸡养殖基地，挑选采集日龄分别在0、81、119、156、210 d的藏鸡共计150只，按不同的发育程度分为5组，每组30只，其中15只雄性、15只雌性。

在统一饲养的条件下，藏鸡自由饮水采食。屠宰前禁食12 h，通过放血法进行屠宰，快速取其右侧胸肌、腿肌置于液氮中，带回实验室储存在-80 ℃备用。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取

（1）取 60 mg肌肉组织至研钵，加入 500 μL Trizol充分研磨均匀，取 0.1 g放入 RNase free 1.5 mL离心管中。

（2）再次添加 500 μL Trizol，漩涡振荡，室温下静置 10 min。

（3）加入 0.2 mL Trizol的氯仿，用振荡器剧烈振荡 15 s，室温放置 3 min。

（4）4 ℃下，12 000g（14 000 r/min）离心 15 min。离心分层，取上层水相移至另一个 RNase free 1.5 mL离心管中，加 0.5 mL 异丙醇，上下颠倒，静置 10 min。

（5）4 ℃下，12 000g（14 000 r/min）离心 10 min。

（6）吸去上清液，加入一倍体积的75%乙醇溶液，洗涤沉淀。

（7）4 ℃下，7 500g，离心 5 min。弃去上清液，晒干静置 10 min。

（8）加入20 μL DEPC处理水，防止RNA降解。

（9）溶于DEPC处理水中，于-70 ℃下冷冻保存。

1.2.2 RNA的定量

（1）每种肌肉组织的RNA样品各取3份，放入RNase free 1.5 mL 离心管中。

（2）在离心管中加入溶解液，稀释RNA，并记录稀释比例。

（3）以溶解液作空白对照，使用紫外分光光度计测量RNA的浓度，测量结果乘以稀释比例即为样品浓度。

（4）多次测量，取其测量结果的平均值，得到全部样品的RNA浓度值，并记录实验数据。

（5）用移液枪及RNase free枪头测量各个肌肉组织RNA的体积，并计算各样品中加入的RNase-Free Water体积，从而将RNA样品的浓度全部调节一致，调整为100 ng/μL。定量后RNA样品浓度的误差将小于5%。

1.2.3 反转录合成cDNA第一链

（1）在逆转录酶的作用下采用RT-PCR技术合成cDNA。

（2）配制RT-PCR反应液，振荡混匀，瞬时离心。反应液各成分及加入量见表1。

表1 RT-PCR反应混合物组成

（3）PCR 仪反应条件设置为 37 ℃、15 min，进行反转录操作，反转录结束，在85 ℃、5 s反应条件下使反转录酶失活。

（4）取 0.2 mL PCR 管，依次加入第一链 2 μL cDNA、1 μL 上游引物（10 μmoL/L）、1 μL 下游引物（10 μmoL/L）、10 μL PerfectShot Taq 和 6 μL灭菌去离子水。振荡混匀离心。

（5）进行PCR反应，反转录PCR程序见表2。

表2 反转录MyoG基因的PCR反应程序

1.2.4 荧光定量PCR

（1）置于冰上加入PCR反应体系。检测内参基因和目的基因。

（2）5倍稀释cDNA溶液，开始点样，然后盖紧8连管盖，瞬时离心。

（3）打开样品槽，将PCR管放入PCR仪进行扩增，调用 PCR 程序：预变性 95 ℃，30 s，变性 95 ℃，5 s，退火 60 ℃，34 s，45 个循环，最后加上溶解程序，然后开始运行。

1.3 数据分析

采用ANOVA程序分析评估不同肌肉组织、性别间MyoG基因表达的差异。建立模型，从而分析MyoG基因的表达与藏鸡生长性状以及胴体性状的相关性。实验结果数据用Mean± SEM的形式表示，P＜0.05为存在差异，P＜ 0.01为存在显著差异。

2 结果与分析

2.1 MyoG基因在藏鸡不同日龄的表达情况

藏鸡胸肌和腿肌中MyoG基因表达结果见图1。在胸肌中，随着日龄的增加，无论雄性鸡和雌性鸡MyoG基因表达水平从开始至81日龄急剧下降，随后一直保持小幅度波动，在210日龄达到较低的水平。

在腿肌中，雄性鸡和雌性鸡在开始到81日龄时，MyoG基因表达水平小幅度降低，随后，雌性鸡的基因表达水平急剧上升，在119日龄达到峰值。从119～154日龄，基因表达水平再次急剧下降，从154日龄至210日龄小幅降低。而雄性鸡MyoG基因表达水平自81日龄缓慢上升，在119日龄到154日龄保持恒定，从154日龄至210日龄小幅上升。

119、154、210日龄雄性藏鸡MyoG基因在胸肌和腿肌表达有显著差异，119日龄时水平最低（P＜0.05或P＜0.01）；在0，81日龄时无显著差异。

119日龄雌性藏鸡MyoG基因在胸肌和腿肌间表达差异显著；在0、81、154、210日龄时无显著差异。

相同日龄的雄性和雌性藏鸡在胸肌中MyoG基因表达无显著差异。仅119日龄的雄性和雌性藏鸡腿肌MyoG基因表达差异显著。

图1 藏鸡MyoG基因5个日龄表达图

2.2 MyoG基因表达与经济性状的相关性

见表3，在雄性鸡胸肌中MyoG基因表达与胫围存在相关关系，与其他性状无显著相关。在雄性鸡胸肌中MyoG基因与各项性状无明显关联。

MyoG基因的表达与各胴体性状间的显著性概率均大于0.05（P＞0.05)，因此，无论雄性鸡雌性鸡在胸肌与腿肌中MyoG基因与胴体性状无显著相关，见表4。

表3 MyoG基因表达与生长性状R的相关性（P值）

表4 MyoG基因表达与胴体性状的相关性

3 讨论

本研究发现，随着日龄的增长，无论雄性鸡或雌性鸡，MyoG基因在胸肌中的表达量从0日龄时的最高开始急剧减少，且在81、119、154、210日龄这4个阶段保持稳定。但在腿肌中，雌性鸡MyoG基因表达量的峰值是在119日龄，而雄性鸡MyoG基因表达量的峰值则是在210日龄，且不同性别之间，MyoG基因在腿肌的表达情况存在较大差异。据此可推测，MyoG基因在胸肌的表达可能与藏鸡性别特异性有关。

而在探讨MyoG基因与经济性状装的相关性时发现，除了在雄性鸡胸肌中MyoG基因表达与胫围存在相关关系，与体斜长、胸骨长、胫骨长、盆骨宽等生长性状均无显著相关。而雌性鸡无论胸肌或是腿肌中MyoG基因表达均与生长性状无显著相关性。由此可见，MyoG基因与雄性鸡生长性状的相关性大于雌性鸡，本研究所选取的研究对象发育阶段和分析对象需要我们进一步扩大样本。