自研利伐沙班片与原研制剂体外溶出行为一致性评价

张玉莉，孙宇宏，王晓梅，魏小亮，党珍，马超，孙建敏＊

（1.陕西国际商贸学院，陕西咸阳 712046；2.陕西步长高新制药有限公司，陕西西安 710119）

利伐沙班是一种新型口服抗凝药物，通过直接抑制凝血因子Xa来阻断内源性凝血途径和终止外源性凝血途径，从而防止血栓形成。其治疗窗宽，用药后无需进行常规监测，与食物、药物相互作用小，因而在血栓防治方面有巨大潜力，临床上主要用于预防髋关节或膝关节置换术后，患者深静脉血栓和肺栓塞的形成[1-7]。该药物由德国拜耳公司研发，商品名为Xarelto®，2008年获得欧盟许可上市，2009年在中国批准进口上市，目前国内无国产利伐沙班片上市。

利伐沙班为BCS分类Ⅱ类药物，即低溶解、高渗透药物，溶出是影响药物吸收的限速步骤，溶出行为可影响产品的生物利用度。本试验在模拟人体消化道内体液的4种基本介质中，对自研制剂进行溶出曲线考察，并与原研制剂溶出曲线进行比较，采用相似因子法对其进行体外溶出一致性评价。

1 仪器与试剂

智能溶出仪（型号：vision®Elite 8TM，Teledyne Hanson Research）；紫外分光光度仪（型号：UV-2700，Shimadzu Corporation）；分析天平[型号：ML204T，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；pH计（型号：PB-21，梅特勒-托利多国际股份有限公司）。

利伐沙班对照品（15-NOV-17-00，Quality Control Chemicals Inc.，USA）；利伐沙班片原研制剂（商品名：拜瑞妥®，规格10mg，批号：BXHEET1，Bayer Pharma AG公司生产）；利伐沙班片自研制剂（规格：10 mg，批号17X101，陕西步长高新制药有限公司生产）；乙腈为色谱纯（Merk公司）；十二烷基硫酸钠（SDS）、盐酸、磷酸二氢钾、氢氧化钠、醋酸钠、冰醋酸等均为分析纯；水为自制纯化水。

2 方法与结果

2.1 溶出度测定方法的建立

参照 FDA 官网“Dissolution Methods”项下利伐沙班片溶出数据库中的条件和相关文献[8-9]，在预实验的基础上初步建立溶出度测定方法，具体如下。

2.1.1 对照品溶液的配制

取利伐沙班对照品约11 mg，精密称定，置于100 mL量瓶中，加乙腈50 mL，超声使溶解，放冷，用乙腈稀释至刻度，摇匀，精密量取5 mL，置50 mL容量瓶中，加溶出介质稀释至刻度，摇匀即得。

2.1.2 操作方法

照《中国药典》2015版第四部通则0931溶出度与释放度测定法，采用第二法（桨法）装置，以含0.2%十二烷基硫酸钠的pH 4.5醋酸盐缓冲液900 mL为溶剂，转速为 75 r/min，依法操作，30 min取样，取溶液10 mL，滤过，取续滤液，即得。照紫外-可见分光光度法（《中国药典》2015年版四部通则0401），在250 nm的波长处测定样品的吸光度，计算在各个时间点的平均累积溶出度。

2.2 方法学验证

2.2.1 专属性

参照“2.1.1”项下的方法操作，配制对照品溶液；取利伐沙班自研制剂适量，研细，精密称取适量（约相当于利伐沙班11 mg），置于100 mL量瓶中，加乙腈60 mL，超声处理30 min使利伐沙班溶解，放冷，用乙腈稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液5 mL，置 100 mL量瓶中，加溶出介质稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。按处方比例配制空白辅料样品，并按上述方法制成空白溶液。分别取空白溶液、供试品溶液及对照品溶液在200～400 nm波长处进行紫外扫描。结果表明，对照品溶液和供试品溶液均在250 nm波长处有最大的吸收，空白辅料在此处无吸收，故空白辅料不干扰主成分的测定，本方法专属性良好。

2.2.2 仪器精密度

取“2.1.1”试验项下对照品溶液作为仪器精密度测定溶液，照紫外-可见分光光度法，在250 nm波长处测定吸光度，重复测定6次，吸光度RSD为0.11%，仪器精密度良好。

2.2.3 线性关系

称取利伐沙班对照品约11 mg，精密称定，置50 mL量瓶中，加乙腈30 mL，超声使溶解，放冷，用乙腈稀释至刻度，摇匀，作为储备液。用溶出介质依次稀释，制成浓度约为 3.4、6.8、9.1、11.4 μg/mL和13.6 μg/mL的溶液，照紫外-可见分光光度法，测定在250 nm波长处吸光度。以浓度（μg/mL）为横坐标、吸光度为纵坐标绘制线性回归曲线，得线性方程为y=0.05019x+0.00267，r2=1.0000。结果表明，利伐沙班浓度在3.408～13.632 μg/mL内线性关系良好。

2.2.4 重复性试验

取自研制剂，按照“2.2.1”项下的供试品制备方法，平行制备6分样品，滤过，在250 nm处检测吸光度，记录测定结果，见表1，表明本方法重复性良好。

2.2.5 中间精密度试验

取同一批次自研片，不同日期、不同人员使用不同仪器，按“2.4.5重复性试验”项下操作进行试验，结果见表1，表明本方法中间精密度良好。

2.2.6 回收率试验

精密称定利伐沙班对照品约11 mg、空白辅料约 8 mg，置于 100 mL 量瓶中，加乙腈 60 mL 超声溶解，放冷，加乙腈稀释至刻度，摇匀，滤过，分别精密量取 3 mL、4 mL、5 mL，置 50 mL 量瓶中，加溶出介质稀释至刻度，摇匀，制成相当于利伐沙班溶出度达60%、80%、100%的系列溶液，每个浓度同法配制3份。照“2.1.3”项下方法，在250 nm的波长处测定吸光度，结果见表2。3个浓度共9份样品中利伐沙班的回收率均大于99%，RSD均在2%以内，表明该测定方法的准确度良好。

表1 重复性、中间精密度试验结果（n=6）

表2 回收率试验结果

2.2.7 溶液稳定性

照“2.2.1”项下配制对照品溶液及供试品溶液，在室温下放置，分别于 0、2、4、8、12h在250 nm波长处测定吸光度。结果利伐沙班对照品及供试品吸光度无明显变化，RSD均小于2%，溶液稳定。

2.2.8 滤膜吸附试验

取利伐沙班片1片至1 000 mL量瓶中，加900 mL的溶出介质，超声处理30 min，放冷至室温，摇匀，过滤，滤液用聚醚砜0.45 μm滤膜过滤，分别弃去0 mL、1 mL、3 mL、5 mL、7 mL、10 mL 初滤液后，作为滤膜吸附考察用溶液，取各溶液分别在250 nm波长处测定吸光度，记录结果，结果见表3，表明滤膜对样品无吸附。

2.3 溶出曲线的测定与评价

2.3.1 溶出介质的配制

含0.2%十二烷基硫酸钠（SDS）的pH4.5醋酸盐缓冲液：取 2.99 g醋酸钠，置于 1 000 mL 水中，加1.66 mL冰醋酸和20 mL的10%SDS溶液，用氢氧化钠试液或冰醋酸调节pH至4.50±0.1。

表3 滤膜吸附试验结果

pH 4.5醋酸盐缓冲液：取2.99 g醋酸钠，置于 1 000 mL水中，再加入 2 mol/mL醋酸溶液 1 4 mL，摇匀，即得，用氢氧化钠试液或冰醋酸调节pH至4.50±0.1。

0.1 mol/mL 盐 酸溶液：取浓盐酸溶液 9 mL，加水稀释至 1 000 mL，摇匀，即得。

pH 6.8磷酸盐缓冲液：将0.2 mol/mL磷酸二氢钾溶液 2 50 mL 与 0.2 mol/mL 氢 氧化钠溶液 1 12.0 mL 溶液混合，加水稀释至1 000 mL，用氢氧化钠试液或冰醋酸调节pH至6.8±0.1。

2.3.2 不同溶出介质的溶液稳定性考察

按“2.2.1”项下配制供试品溶液，分别用溶出介质 pH 4.5+0.2% SDS醋酸盐缓冲液、pH 4.5醋酸盐缓冲液、0.1 mol/mL盐酸溶液、pH 6.8磷酸盐缓冲液稀释至100 mL，各供试品溶液在室温放置0、2、4、8 h 和 12 h，在 250 nm 波长处测定吸光度，考察不同溶出介质中的溶液稳定性，见表4。结果表明利伐沙班分别在4种溶出介质中，溶液于室温放置12 h内较稳定。取“2.2.1”项下对照品溶液作为仪器精密度测定溶液，照紫外-可见分光光度法，在250 nm波长处测定吸光度，重复测定6次，吸光度RSD均小于0.5%，仪器精密度良好。

表4 不同溶出介质中溶液稳定性试验

2.3.3 不同介质溶出曲线的测定

取本品自研制剂及原研制剂各12片，以pH 4.5+0.2% SDS醋酸盐缓冲液、pH4.5醋酸盐缓冲液、0.1 mol/mL盐酸溶液、pH 6.8磷酸盐缓冲液各900 mL为溶出介质，转速为75 r/min，分别于规定的不同时间点，取溶出液10 mL，滤过，取续滤液作为供试品溶液，溶出杯中及时补充10 mL测定温度的溶出介质；对照品溶液配制参照“2.1.1”项下。取上述各溶液，照紫外-可见分光光度法（《中国药典》2015年版四部通则0931第二法），于250 nm的波长处分别测定吸光度，计算每片的溶出度，绘制溶出曲线，见图1，f2因子汇总见表5。其中在pH 4.5+0.2% SDS醋酸盐缓冲液中，15 min内自研制剂和原研制剂累积溶出量均达到85%以上，可认为相似；在其余3种不同溶出介质中，自研制剂与原研制剂的溶出行为也相似，具有一致性（f2因子均＞50%）。

图1 自研制剂与原研制剂在不同溶出介质中的溶出曲线（n=12）

表5 不同介质中的f2因子（n=12）

2.3.4 不同转速条件

取自研制剂与原研制剂各12片，用pH 4.5+0.2%SDS醋酸盐缓冲液作溶出介质，参照“2.1.2”，分别采用50、75 r/min不同转速测定两者的溶出曲线，在 0、10、15、30、45 min 和 60 min 分别取 样，并采用相似性f2因子法评价，结果见表6，表明本品自研制剂和参比制剂的溶出行为均相似（f2因子均＞50%），转速为 50 r/min时，15 min时累积溶出度不到80%，30 min时累积溶出度不足85%，低于75 r/min 时 15 min、30 min 的累积溶出量。

表6 不同转速的溶出曲线对比（n=12）

3 结论

本试验建立紫外-可见分光光度法检测利伐沙班片溶出度方法，该方法经验证，专属性强，准确度高，操作简单，可作为体外一致性评价的重要检测方法。

根据国家食品药品监督管理总局发布的《普通口服固体制剂溶出曲线测定与比较指导原则》，通过比较自研制剂与原研制剂体外多条溶出曲线相似性的方法，评价仿制制剂的质量一致性。利伐沙班生物药剂学分类属于2类，其生物利用度与溶出过程密切相关。溶出度研究在口服固体制剂的开发评价中起着关键性作用。本试验根据利伐沙班片的药代动力学参数，显示出利伐沙班在胃中释放、在小肠吸收，生物利用度较高，因此模拟体内的环境，确定溶出介质为pH 4.5+0.2% SDS、pH 4.5醋酸盐缓冲液、0.1 mol/mL盐酸溶液、pH 6.8磷酸盐缓冲液，经对比研究，自研制剂与原研制剂4条溶出曲线均相似，进一步考察不同转速下，2种制剂的溶出曲线，也显示出一致性，同时表明本品对转速的改变较敏感。本试验为本品的生物等效性试验提供了依据，极大地减少BE的风险。