5个山东地方鸡种及培育品系（种）中绿壳蛋基因型检测

周艳　雷秋霞　韩海霞　李福伟　高金波　刘玮　刘杰　曹顶国

摘要：为了检测山东省地方鸡种及其培育品系（种）中绿壳蛋基因的分布情况，本研究设计了多重PCR引物对部分山东地方鸡种及绿壳蛋鸡专门化品系进行基因型鉴定。结果表明：汶上芦花鸡绿壳系公鸡、母鸡中的绿壳基因型频率（ LS/LS）分别为0.9667和1.0000;某绿壳蛋鸡专门化品系中绿壳基因纯合型（LS/LS）个体比例只有7.69%，杂合型（LS/NN）比例高达92.31%;在琅琊鸡、汶上芦花鸡和鲁禽鸡中均未检测到绿壳基因型。本检测结果与各供试群体的遗传背景相符，说明本检测方法准确。

关键词：绿壳蛋基因;分子检测;山东地方鸡种;绿壳系

Genotype Detection of Blue - Shelled Eggs in FiveShandong Local Chicken Breeds and Breeding Lines （ Species）Zhou Yan， Lei Qiuxia， Han Haixia， Li Fuwei， Gao Jingbo， Liu Wei， Liu Jie， Cao Dingguo

Abstract To investigate the distribution of blue - shelled gene in Shandong local chicken breeds andbreeding lines （species） ， multiplex PCR primers were set to detect the genotypes of some Shandong localchicken breeds and blue - shelled laying hens. The results showed that the frequencies of blue - shelled geno-type （ LS/LS） in roosters and hens of Wenshang barred chicken were 0.9667 and l.0000， respectively. Thefrequency of blue - shelled gene （ LS/LS） in the special blue - shelled strain was only 7. 69% ， but the heter-ozygous （ LS/NN） frequency was 92.31%. The blue - shelled genotype did not found in Langya chicken，Wenshang barred chicken and Luqin chicken. The results were consistent with the genetic background of thetested populations， which indicated that the method built in this research was accurate and fast.

Keywords Blue - shelled gene; Molecular detection; Shandong local chicken breeds; Blue - shelledstrain

雞蛋壳颜色是重要的经济性状，近年来，绿壳蛋因其颜色符合当前人们追求健康的需求，因而受到广泛欢迎。绿壳蛋鸡是稀有鸡种，我国只有东乡绿壳蛋鸡、长顺绿壳蛋鸡等几个地方鸡种产绿壳蛋，而且产蛋量不高。为迎合市场需求，国内育种企业通过与高产蛋鸡杂交的方式培育绿壳蛋鸡专门化品系进行商业化生产。但在实际生产中，由于公鸡和杂合型母鸡均不能通过表型检测其基因型，导致绿壳蛋鸡纯系的获得较为困难，而常规的测交鉴定和纯系选育等方式不但周期长，而且人力物力浪费巨大。分子生物学的发展给家禽育种提供了更多途径，通过分子标记鉴定绿壳蛋基因型不但准确率高、极大地节约成本，而且能加快育种进程、推进育种进展。

Punnett[1]认为鸡蛋的绿壳性状是1号染色体上显性绿壳基因（OocVan，O）作用的结果。Bitgood等[2]将鸡的绿壳基因（O）定位于1号染色体短臂上。Bartlett等[3]发现绿壳基因与内源病毒因子（evl）及豆冠位点（P）连锁。Bitgood等[4]进一步验证了Bartlett等的结论，证明O-P的连锁，并将其定位在GGA1的短臂上。王哲鹏等[5]研究表明鸡绿壳蛋表型是由OATP基因大片段插入引起。Wang[6]和Wragg等[7]均进一步揭示鸡蛋绿壳性状的分子机制是由有机阴离子转运多肽IB3基因（solute carier organic anion trans-porter familv member IB3，SLCOIB3，位于1号染色体65 319 441～65 338 450 bp）的5侧翼区插入鸟类逆转录酶病毒（EAV - HP，长度约为4.2kb）所造成。当EAV - HP插入到SLC01 83的5侧翼区后，导致SLCOIB3基因在子宫部特异表达，从而使蛋壳颜色表现为绿壳。针对这一原理，本研究设计多重PCR引物对部分山东地方鸡种及绿壳蛋鸡专门化品系进行绿壳蛋基因型鉴定，以期为山东地方鸡种创新利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

琅琊鸡、汶上芦花鸡和鲁禽鸡均取自山东省地方鸡品种资源活体基因库，汶上芦花鸡绿壳系取自山东龙盛农牧集团，某绿壳蛋鸡专门化品系来自山东省某育种企业。238只待测个体均为随机取样，翅下静脉采血约l mL，ACD抗凝，常规酚/氯仿提取基因组DNA，- 20 ℃保存备用。

1.2 主要试剂

2×Taq PCR MasterMix、Marker I购自天根生化科技（北京）有限公司，琼脂糖、蛋白酶K、Tris饱和酚以及常规耗材购自济南金博生物科技有限公司。

1.3 引物设计

根据已发表的SLCOIB3（GeneBank accessionnumber：JN020139.1）和EAV - HP（GenBank ac-cession number： JF837512）序列，设计1条上游引物F和2条下游引物R1和R2（F：5'-TGAC-CAGCGTAGATAAACAT-3; R1：5- TCAGAAAGACCCATAGAAAT-3 ;R2：5 '-AACACGTAGCCTAT-AGCAA T-3），扩增片段长度为223 bp和397 bp。

1.4 待测个体基因型检测

多重PCR扩增体系（25μL）：2×Taq PCRMasterMix 12.5μL、ddH2O 8.5μL、F引物（10pmol/μL）1.OμL， R1引物（10 pmol/μL）1.0μL，R2引物（10 pmol/μL）1OμL，模板DNA（50ng/μL）1.0μL。

PCR扩增程序：95℃ 3 min;95℃ 30 s，50℃30 s，72℃ 20 s，共36个循环;72℃5 min，4℃保存。

PCR产物检测：120V、1.5%琼脂糖凝胶电泳30 min，凝胶成像系统拍照保存用于后续基因型判定。

1.5 基因型判定

PCR产物只检出片段长度为397 bp的单一目的条带，表明该个体基因型为NN/NN（非绿壳纯合型）;PCR产物只扩增出片段长度为223 bp的单一目的条带，表明该个体基因型为LS/LS（绿壳纯合型）;PCR产物扩增出223 bp和397 bp两条目的条带，表明该个体基因型为LS/NN（绿壳杂合型）。

2 结果与分析

2.1 多重PCR检测结果

由图1可知，该引物组合扩增出的目的片段符合预期，且条带单一，边缘清楚，无非特异条带干扰，杂合子中的两条带能够清楚分离。分别选取绿壳纯合型（ LS/LS）和非绿壳纯合型（NN/NN）各2个纯合个体送济南力戈科技有限公司测

2.2 供试群体绿壳基因型检测结果

由表2可知，汶上芦花鸡绿壳系公鸡30个個体中有29个为绿壳纯合型，占96.67%，绿壳等位基因LS频率为0.9833;28个母鸡个体均为绿壳纯合型，绿壳等位基因LS频率为1.0000。某绿壳蛋鸡专门化品系13个母鸡个体中绿壳纯合型只有1个，绿壳基因杂合型比例达92.31%。在琅琊鸡、汶上芦花鸡和鲁禽鸡的公、母鸡中均未检测到绿壳基因型，非绿壳纯合型比例为100%。

3 讨论与结论

选用的5个供试群体中，包含2个山东地方鸡种、2个专门化品系和1个培育品种，共238个待检个体的基因型判定结果符合预期，其中在琅琊鸡、汶上芦花鸡和鲁禽鸡中均未发现有绿壳蛋基因型，汶上芦花鸡绿壳系中的绿壳蛋基因纯合型比例较高，在58个供试个体中仅检出1例杂合序，BioEdit软件比对结果表明测序结果与原设计序列相符。基因型。而某绿壳蛋鸡专门化品系中杂合型比例高达92.31%，因此在后续选育过程中需要加大提纯力度。检测结果表明设计的多重PCR引物组合适应性强、准确率高，无论在地方鸡种、专门化品系还是培育品种中均能准确区分、鉴定绿壳蛋纯合型、杂合型以及非绿壳蛋纯合型个体。

虽然分子生物学手段大大提高了绿壳蛋基因选择的准确率、缩短选择时间、加快育种进程[8]，但绿壳性状是由多基因控制的表型性状[9]，单一分子标记不能完全解决这一问题。为了充分挖掘利用这些为数不多的宝贵遗传资源[10]，随着分子生物学技术的发展，应该继续研究其分子机理，全面揭示其遗传机制，以期将这一重要经济性状更好地应用于生产实际。

参考文献：

[1] Punnett R C. Genetic study in poultry ： IX. The blue egg[J] .Journal of Cenetics. 1933 . 27 ： 465 - 470.

[2] Bitgood J J. Shoffner R N. Otis J S， et al. Mapping of thegenes for pea comb. blue egg， barring， silver. and bloodgroups A， E， H， and P in the domestic fmvI[J] . Poultry Sci-ence. 1980. 59（ 8） ： 1686 - 1693.

[3] Bartlett J R. Jones C P， Smith E J. Linkage analysis of endog-enous viral eleruent l. blue eggshell， and pea comb loci inchiickens[J] . The Joumal of Heredity， 1996 ， 87 （1） ： 67 -70.

[4] Bitgood J J. Briles R W. Briles W E. Further tests for geneticlinkages of three morphological traits， three blood groups， andbreak points of hvo chromosome translocations on chromosomeone in the chicken [J] . Poultry Science ， 2000 . 79 （3） ： 293 -295.

[5] 王哲鹏，邓学梅，吴常信.鸡绿壳蛋表型由OATP基因大片段插入引起[C]//安全优质的家禽生产第十五次全国家禽学术讨论会论文集.广州：华南理工大学出版社，2011：18 - 20.

[6] Wang Z，Qu L，Yao J，et al. An EAV- HP insertion in 5flanking region of .SLCOIB3 causes blue eggshell in the chicken[J]. PLoS Genetics， 2013，9（1）：e1003183.

[7] Wragg D，Mwacharo JM，Alcalde JA，et al. Endogenous ret-rovirus EAV - HP linked to hlue egg phenotype in MapuchefoWI[Jl. PLoS One. 2013， 8（8）： e71393.

[8] 张吴，申杰，吴艳，等.鸡绿壳蛋基因分子鉴定方法在湖北地方鸡育种群体中的检测应用[J].中国家禽，2016，38（12）：66 -68.

[9] 陈林，伍革民，韩雪，等.长顺绿壳蛋鸡的.SLCOIB3基因分型及分子选育[J].黑龙江畜牧兽医，2017（8）：69 -70.

[10] 王晨，张丹萍，张浩，等.5个绿壳蛋鸡群体中EAV - HP在.SLCOIB3基因5一非编码区插入整合频率和类型的研究[J].中国畜牧兽医，2014，41（10）：183 -188.