苦荞茶多糖诱导人肺腺癌A549细胞凋亡的线粒体机制

杨二万，张 敏，杨兴斌，杨红燕,*

（1.空军军医大学航空航天医学系，陕西 西安 710032 ；2.陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西 西安 710119 ）

苦荞（Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn）种子经过筛选、烘烤等工序可制成苦荞茶，因其具有抗氧化、抗衰老、增强免疫力等众多生物学功能，被认为是一种“健康饮品”而备受欢迎[1-4]。苦荞茶多糖（tartary buckwheat tea polysaccharide，TBTP）是苦荞茶最主要的活性成分之一，本课题组利用水提醇沉法结合超声辅助技术，使TBTP提取率由3%提高至8%左右，为苦荞茶活性物质研究及应用、推广提供了一定的理论依据[5-6]。研究表明，苦荞多糖能够呈剂量依赖性地明显清除羟自由基，具有良好的抗氧化活性，使人肝癌细胞染色质DNA断裂、细胞核形态聚缩，抑制肝癌细胞增殖[7]。Wu等的研究发现荞麦多糖可诱导白血病细胞分化并抑制其增殖[8]。苦荞茶和苦荞在生物活性上有诸多相似之处，而前者作为一种更加便捷的食品，在生活中具有更好的推广和应用前景。然而，TBTP对肿瘤的影响及作用机制尚不清楚。因此，本研究以超声波辅助提取的TBTP为原材料，对人肺腺癌A549细胞进行处理，观察细胞增殖、凋亡情况以及氧化应激损伤指标，探讨TBTP对A549细胞凋亡的影响并探索其机制，以期为苦荞茶保健食品的开发及产品推广提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苦荞茶购自四川西昌市滋元食品有限公司。TBTP采用超声波技术辅助水提醇沉获得，主要包括D-甘露糖、D-核糖、L-鼠李糖、D-葡糖醛酸、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-木糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖等，其相对含量依次为4.47%、3.09%、8.55%、2.52%、6.28%、22.08%、12.49%、26.88%和13.64%[7]。A549细胞购自中国科学院细胞库。

RPMI-1640、胎牛血清 美国Hyclone公司；DHE上海碧云天生物技术有限公司；碘化丙啶、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT）、JC-1线粒体膜电位检测试剂盒 美国Sigma公司；Mito SOX荧光染料 美国Thermo Fisher公司；Bcl-2、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）、细胞色素c、剪切型半胱氨酸蛋白酶（caspase）-3、细胞色素c氧化酶IV（cytochrome c oxidase IV，COX IV）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶一抗 美国Abcam公司；线粒体分离试剂盒 美国Biovision公司。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-2FD超净工作台 苏州净化设备有限公司；倒置显微镜 日本Olympus公司；多功能酶标仪 德国BMG Labtech公司；GUAVA easy Cyte TM8HT流式细胞仪 美国Millipore公司；凝胶电泳系统、湿转系统、凝胶成像系统 美国Bio-Rad公司；LSM800型激光扫描共聚焦显微镜 德国Zeiss公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养及处理

A549细胞在含体积分数10%胎牛血清的RPMI-1640培养基、5% CO2、37 ℃条件下培养。当细胞生长至80%左右时，分为空白对照组和50、100、200、400、800 μg/mL TBTP处理组，进行相关指标的检测。

1.3.2 MTT 法检测细胞增殖

用上述不同质量浓度TBTP分别处理A549细胞12、24、48 h后，每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT反应4 h，弃去培养液后加入150 μL二甲基亚砜，于37 ℃摇床充分振摇0.5 h，在多功能酶标仪490 nm波长处测定各处理组的OD值。细胞增殖率以各处理组与空白对照组OD值之比表示。

1.3.3 流式细胞术检测细胞凋亡

各组细胞处理结束后用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）清洗2 遍，使用100 μL 1×Binding Buffer重悬细胞，加入5 μL Annexin V-FITC染液充分混匀，再加入5 μL碘化丙啶在室温、避光条件下染色15 min。染色结束后轻轻混匀细胞悬液，采用流式细胞术检测细胞凋亡变化。

细胞经Annexin V-FITC和PI双染之后，流式细胞图被分成4 个象限：第一象限为晚期凋亡细胞；第二象限为坏死细胞；第三象限为未发生凋亡的细胞；第四象限为早期凋亡细胞。细胞凋亡率＝晚期细胞凋亡率+早期细胞凋亡率，即第一和第四象限百分率之和。

1.3.4 细胞ROS水平检测

采用DHE染色法检测细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平。接种于共聚焦培养皿中的A549细胞经TBTP处理结束后，使用0.5 μmol/L DHE染液在37 ℃孵箱中染色30 min，再用PBS清洗3 遍，加入1 mL完全培养基后在激光扫描共聚焦显微镜下采集荧光信号。DHE红色相对荧光强度增加表示ROS水平增加。

1.3.5 细胞线粒体ROS水平检测

采用Mito SOX荧光染料检测细胞线粒体内ROS水平。接种于共聚焦培养皿中的A549细胞经TBTP处理结束后，使用5 μmol/L Mito SOX染液于37 ℃培养箱染色10 min，再用PBS清洗3 遍，加入1 mL完全培养基后在激光扫描共聚焦显微镜下采集荧光信号。Mito SOX红色相对荧光强度增加表示线粒体ROS水平增加。

1.3.6 细胞线粒体膜电位检测

A549细胞接种于共聚焦培养皿中，TBTP处理结束后加入10 μg/mL JC-1染液，于37 ℃下孵育15 min，用PBS清洗3 遍后加入1 mL完全培养基，在激光扫描共聚焦显微镜下采集荧光信号。当线粒体膜电位低时，JC-1产生绿色荧光；当线粒体膜电位高时，JC-1产生红色荧光，以红/绿相对荧光强度比来反映线粒体膜电位的变化。

1.3.7 Western blot检测凋亡蛋白表达

各组细胞处理结束后，用预冷PBS清洗3 次，加入含苯甲基磺酰氟和蛋白酶抑制剂的细胞裂解液进行裂解，收集裂解液，4 ℃、12 000 r/min离心20 min，留取细胞上清液，采用BCA法测定蛋白质量浓度，调至统一质量浓度后100 ℃煮10 min使蛋白变性。进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、封闭，加入相应一抗（体积比为1∶1 000）4 ℃孵育过夜；加入二抗（体积比为1∶5 000）室温孵育2 h，于凝胶成像系统中曝光、采集图像，以目的蛋白与相应内参（分别为β-actin和COX IV）条带相对灰度的比值表示蛋白的相对表达量。

1.4 数据统计与分析

2 结果与分析

2.1 TBTP对A549细胞增殖的影响

图1 TBTP对A549细胞增殖的影响Fig. 1 Effect of TBTP on A549 cell proliferation

如图1所示，TBTP能够以时间和剂量依赖性的方式抑制A549细胞的增殖。TBTP处理A549细胞12、24、48 h时，随着质量浓度的增加，细胞增殖率显著减低（P＜0.05），提示TBTP与A549细胞增殖率间存在剂量依赖关系。同时，相同质量浓度TBTP处理A549细胞时，随着处理时间的延长，细胞增殖率显著降低（P＜0.05），提示TBTP与A549细胞增殖率间存在时间依赖关系。100、200、400 µg/mL TBTP处理A549细胞24 h对细胞增殖的抑制作用明显，且细胞状态尚可完成实验，因此进一步的机制研究应用上述条件处理。

2.2 TBTP对A549细胞凋亡的影响

图2 TBTP对A549细胞凋亡的影响Fig. 2 Effect of TBTP on A549 cell apoptosis

如图2所示，与空白对照组相比，100、200、400 µg/mL TBTP处理组细胞凋亡率均显著增加（P＜0.05）。同时，随着TBTP质量浓度的增加，A549细胞凋亡率显著增加（P＜0.05），进一步验证了TBTP与细胞凋亡率的剂量依赖关系。

2.3 TBTP对A549细胞以及线粒体内ROS释放的影响

图3 TBTP对A549细胞以及线粒体内ROS水平的影响Fig. 3 Effect of TBTP on ROS level in mitochondria and A549 cells

如图3所示，与空白对照组相比，100、200、400 µg/mL TBTP处理组A549细胞内相对荧光强度均显著增加（P＜0.05），提示TBTP促进细胞内ROS的产生；随着TBTP质量浓度的增加，细胞内相对荧光强度也显著增加（P＜0.05）。Mito SOX荧光染料检测线粒体ROS水平结果与DHE染色法检测细胞内ROS水平结果显示出一致的趋势，即TBTP能够呈浓度依赖性地显著增加线粒体ROS的生成（P＜0.05）。

2.4 TBTP对A549细胞线粒体膜电位的影响

图4 TBTP对A549细胞线粒体膜电位的影响Fig. 4 Effect of TBTP on mitochondrial membrane potential of A549 cell

如图4所示，与空白对照组相比，100、200、400 µg/mL TBTP处理组细胞红/绿相对荧光强度比均显著降低（P＜0.05），提示TBTP具有降低细胞线粒体膜电位的作用。随着TBTP质量浓度的增加，细胞线粒体膜电位显著降低（P＜0.05）。

2.5 TBTP对A549细胞凋亡相关蛋白表达的影响

图5 TBTP对A549细胞凋亡相关蛋白表达的影响Fig. 5 Expression of apoptosis-related proteins in A549 cells after TBTP treatment

如图5所示，与空白对照组相比，100、200、400 µg/mL TBTP处理组细胞Bcl-2蛋白及线粒体内细胞色素c表达显著降低，而Bax和剪切型Caspase-3蛋白表达显著增加（P＜0.05），提示TBTP能够显著降低Bcl-2/Bax，促进线粒体细胞色素c释放及剪切型Caspase-3表达，进而促进细胞凋亡。随着TBTP质量浓度的增加，Bcl-2/Bax比和线粒体内细胞色素c水平显著降低，而剪切型Caspase-3表达显著升高（P＜0.05）。

3 讨 论

流行病学资料显示，肺癌是我国最常见的肿瘤之一，其发病率和死亡率均居恶性肿瘤首位[9]。80%以上的肺癌患者为非小细胞肺癌，70%左右的患者就诊时已属肿瘤晚期，失去了手术机会，因此化疗成为非小细胞肺癌的主要治疗手段之一[10]。然而，化疗的毒副作用使得部分肺癌患者不能耐受，严重影响患者生存和生活质量。植物多糖为天然的大分子生物活性物质，具有抗肿瘤、增强免疫力、抗衰老等多种生物学效应。相较于化学合成药物，从天然植物分离获得的植物多糖毒副作用更小且作用机制广泛，同时，生产工艺的改进为植物多糖的提取提供了依据，因此植物多糖具有广阔的临床应用前景[11-14]。TBTP是苦荞茶中发挥保健功能和具有临床用途的主要活性物质，但它对肺癌细胞的影响及机制尚不清楚。

本研究发现，TBTP处理能够显著抑制A549细胞的增殖，促进细胞凋亡。TBTP在50～800 µg/mL范围内对A549细胞增殖和凋亡呈现良好的剂量和时间依赖关系。进一步的机制研究结果显示，TBTP处理显著促进了A549细胞内和线粒体ROS的生成，降低线粒体膜电位水平，提示它可能通过增加细胞的氧化损伤发挥抑制A549细胞增殖、促进细胞凋亡的作用。此外，TBTP还呈剂量依赖性地抑制Bcl-2/Bax比，促使细胞色素c从线粒体内外流至细胞质，提高细胞内剪切型Caspase-3的水平，促进细胞凋亡。

苦荞具有广泛的生物学活性。贾乔瑾等发现从苦荞中提取出的苦荞凝集素能够抑制结肠癌细胞蛋白合成、调控细胞microRNA水平，因此可以剂量依赖性地抑制3 种结肠癌细胞增殖[15]。郭晓娜等的研究表明，苦荞蛋白TBWSP31能够调控乳腺癌Bcap细胞周期，上调抑癌基因Fas的表达，发挥抗乳腺癌的作用[16]。同时，苦荞种子、壳及茎叶中黄酮、多酚、蛋白等多种成分都对细胞氧化损伤有明确的调控作用[17]。本研究证实了苦荞茶主要成分TBTP促进A549细胞ROS生成及细胞凋亡的作用，与先前的苦荞抗肿瘤效应研究基本一致，且丰富了苦荞的药理学作用。细胞凋亡是抑制肿瘤细胞生长的主要方式之一，而线粒体是调控该过程最重要的细胞器[18-24]。线粒体为细胞供能的同时会产生ROS，后者成为细胞凋亡的诱导信号分子之一。ROS可直接引起线粒体通透性转换孔开放，降低线粒体膜电位，一方面影响细胞能量代谢，另一方面致使线粒体内的凋亡启动因子细胞色素c释放入胞质，激活Caspase依赖的细胞凋亡途径[24-25]。Bcl-2家族分子亦参与线粒体形态和功能的调控。研究表明，Bcl-2家族分子，尤其是Bax/Bcl-2同源拮抗剂激活可以促进线粒体分裂蛋白1定位于线粒体外膜，促进线粒体片段化；也可以通过改变Bcl-2/Bax比调节线粒体外膜的通透性，参与细胞凋亡的调控[26-30]。结合本实验结果，TBTP可能通过调控线粒体ROS生成直接诱导A549细胞凋亡；同时，通过影响Bcl-2/Bax比调节线粒体功能，间接诱导细胞凋亡。

综上所述，TBTP能够增加ROS的生成、降低线粒体膜电位，有效抑制A549细胞增殖、促进细胞凋亡，这为苦荞茶的抗肿瘤效应提供了实验参考，也为该化合物的临床应用提供了理论依据。然而，本研究为A549细胞的体外实验，TBTP抗肺癌作用及机制还需进一步的动物和临床实验论证和研究。