硒化魔芋葡甘寡糖的合成及其抗氧化活性

刘启顺，陈 玮，巩凤芹,2，谭海东，尹 恒,*

（1.中国科学院大连化学物理研究所天然产物与糖工程组，辽宁 大连 116023 ；2.大连海洋大学海洋科技与环境学院，辽宁 大连 116023 ）

魔芋是天南星科磨芋属多年生草本植物[1]，其在中国和日本等国具有很长的食用历史。中国早在2 000多年前就开始栽培魔芋，食用历史悠久，但在20世纪80年代中期才开始真正的魔芋精粉加工[2]。魔芋主要分布在我国的四川、云南、贵州、陕西等地，此外重庆、湖北、湖南、广西、江苏、浙江、甘肃、宁夏、福建等地也有广泛种植。魔芋富含多糖，其葡甘聚糖质量分数一般为30%～55%[3]。魔芋葡甘聚糖又称魔芋多糖，除医学、食品保健外，魔芋多糖在纺织、印染、化妆品、陶瓷、消防、环保、军工、石油开采等方面都有广泛的用途[4]。

魔芋多糖的结构一般认为是由β-1,4-吡喃糖苷键与β-D-葡萄糖和β-D-甘露糖按物质的量比1∶1.6或1∶1.69连接而成，具有部分β-1,3-葡萄糖支链，且主链上每9～19 个糖残基C6位上有一个乙酰基团[5]。有学者认为单糖随机排列于主链上，其他学者则认为单糖组成基本的重复单元而非随机分布[6]。在主链甘露糖的C3位上存在通过β-1,3-糖苷键连接的支链，每32 个糖残基上约有3 个支链，占主链的8%左右[7]。魔芋葡甘聚糖特殊的结构虽使其具有多种生物学功能，但是其在水中为胶体，黏度大、溶解度小，使用不便，因此在各种食品中添加量少，限制了其生物活性在食品中的体现。由魔芋多糖降解成的魔芋葡甘寡糖（konjac oligo-glucomannan，KOGM）分子质量小、在水中可溶、易于吸收，能克服上述问题。有研究表明，KOGM具有多种生物活性，与魔芋多糖相比，魔芋低聚糖具有优良的性能，能够改善食品品质、保鲜食品、改善人体肠道菌群、增强免疫力、调节血糖、血脂[8]、肠道解毒、促进家畜生长和提高肉料比等[9]。

硒是生命必需的微量元素[10]，具有抗衰老、抗肿瘤、调节机体免疫力、影响人和动物的生殖发育、解毒等生物学功能[11]。硒在体内以硒代半胱氨酸的形式构成谷胱甘肽过氧化物酶的活性中心，可清除自由基，抑制脂质氧化或过氧化，引起过氧化物的广泛分解或还原，防止细胞损伤。自由基引发脂质过氧化产生脂质过氧化物是损害机体的最主要途径之一。某些癌症、肿瘤、心血管疾病、克山病、大骨节病和艾滋病等都与体内缺硒有关[12-14]。

因为硒在人体健康中的重要作用，1973年世界卫生组织专家委员会正式宣布硒是人体生理必需的微量元素之一，1994年中国卫生部将硒列为食品营养强化剂。缺硒是一些疾病的诱因，硒过量则会引发中毒，而二者之间的安全范围比较窄。为了使硒更好地发挥其生理保健作用，确定安全合理的日硒摄入量十分必要，但是目前世界各国推荐的硒摄入量尚无统一标准。美国食品与营养委员会提出，要满足机体正常代谢，成人每天摄入硒的安全与适宜范围推荐量为50～200 μg；中国营养学会发布报告认为成人每天适宜的膳食硒摄入量应为50～250 μg；此外，加拿大的推荐量为98～224 μg/d，英国的推荐量为70 μg/d，新西兰的推荐量仅为30 μg/d，芬兰的推荐量为20～30 μg/d。虽然新西兰和芬兰的推荐量较低，但是正常人在该剂量下均无缺硒表现[15]。

一般认为正常人摄入超过生理需要量50 倍的硒有中毒的危险。由于环境高硒、补硒过量或误用药物等原因而摄入过量的硒会引发急性或慢性硒中毒。硒的中毒剂量在食物中为5 mg/kg，在饮用水为0.5 mg/kg。根据体质量计算，如果日硒摄入量在400～800 mg/kg范围内便可能引发急性中毒，表现为指甲和头发脱落，伴随恶心、呕吐、疲劳、腹泻、腹痛、汗液有酸臭味等；严重者表现为支气管炎、高热、直立性低血压、肝肿大，甚至虚脱、呼吸衰竭而死。慢性硒中毒往往是由于长期硒摄入量在2.4～3.0 mg/d而出现的症状[16]。

硒元素不能在体内自行合成，只能靠外部摄入补充。硒主要以无机硒和有机硒两种形式存在，与无机硒相比，有机硒毒性低、副作用小、活性更好。有机硒主要包括硒多糖、硒氨基酸、硒蛋白和硒核酸等，其中硒多糖不但具有无机硒的多种活性，还具有多糖的各种生理功能，并且硒多糖的活性普遍高于硒和多糖，更利于被机体吸收利用[17]。天然提取的多糖中硒含量很低，即使从富硒地区种植的魔芋中提取的多糖含硒量也低于5 mg/kg[18]。

本研究在实验室制备KOGM的基础上，建立了硒化KOGM（selenium-containing KOGM，KOGM-Se）的合成技术（图1），并对其结构和硒含量进行表征，研究其抗氧化活性，以期开发高硒含量的抗氧化有机硒食品原料。

图1 KOGM-Se合成路线示意图Fig. 1 Synthetic route of KOGM-Se

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

KOGM由天然产物与糖工程组实验室自制，聚合度2～10。制备过程参照文献[19]：将5.0 mg/mL魔芋葡甘聚糖与葡甘聚糖酶（酶活力65 U/mg）按照体积比9∶1混合，在25 ℃下反应2 h；离心后，将上清液冷冻干燥得到KOGM。

亚硒酸钠、硝酸（均为分析纯） 天津大茂化学试剂厂；氯化钡（分析纯） 天津光复科技发展有限公司；其他试剂为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

Vector22傅里叶变换红外光谱仪、AVANCE III 400 MHz核磁共振仪 美国Bruker公司；NexION 300D电感耦合等离子体质谱仪 美国Perkin Elmer公司。

1.3 方法

1.3.1 KOGM-Se制备

取0.50 g聚合度2～8的KOGM加入50 mL体积分数0.5%硝酸溶液中，搅拌溶解；加入0.61 g亚硒酸钠和0.86 g氯化钡，搅拌溶解；将上述溶液置于70 ℃反应9 h；加入0.50 g硫酸钠，8 000 r/min离心去除沉淀；上清液用碳酸氢钠中和至中性；向反应液加中入5 倍体积乙醇，产生白色沉淀；抽滤得到固体，用乙醇洗2～3 遍，将滤饼置于真空干燥器中60 ℃干燥2 h，得白色粉末0.4 g。

1.3.2 KOGM-Se结构表征和含量的测定

傅里叶变换红外光谱表征：取样品1 mg与99 mg KBr混合压片，在4 000～400 cm-1范围内进行傅里叶变换红外光谱扫描。

核磁共振分析：在核磁管中加15～25 mg样品和0.5 mL D2O，混合溶解，置于核磁共振仪中扫描分析；化学位移以四甲基硅烷为标准品进行校正。

样品中硒含量的测定：称取一定量样品，加入浓硝酸，在100 ℃的密闭消化罐中消化4 h，以1%超纯硝酸稀释定容，用电感耦合等离子体质谱测定其硒含量。

1.3.3 KOGM-Se体外抗氧化活性分析

1.3.3.1 对羟自由基的清除能力

利用Fenton试剂法[20]检测KOGM及KOGM-Se对羟自由基的清除作用。将样品配成1、2、4、6、8、10 mg/mL溶液。将1.0 mL 9 mmol/L硫酸亚铁溶液、1.0 mL 9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液和1.0 mL待测液混合均匀，加入1.0 mL 8.8 mmol/L过氧化氢溶液启动反应，于37 ℃反应30 min，在510 nm波长处测定溶液的吸光度。阳性对照组为VC，空白对照组为蒸馏水。按式（1）计算羟自由基清除率。

式中：A0为空白对照组的吸光度；Ai为样品组、阳性对照组的吸光度；Aj为1.0 mL水杨酸-乙醇溶液代替1.0 mL硫酸亚铁溶液作试剂空白的吸光度。

1.3.3.2 对超氧阴离子自由基的清除能力

采用邻苯三酚法[21]测定KOGM及KOGM-Se对超氧阴离子自由基的清除作用。将样品配成1、2、4、6、8、10 mg/mL溶液。将5.0 mL 50 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.2）和0.5 mL寡糖溶液混合均匀，于37 ℃水浴预热10 min，加入1.0 mL 3.5 mmol/L邻苯三酚溶液，反应6 min后迅速加入0.5 mL 8 mmol/L HCl终止反应，于420 nm波长处测定吸光度。阳性对照组为VC，空白对照组为蒸馏水。按式（2）计算超氧阴离子自由基清除率。

式中：A0为空白对照组吸光度；Ai为样品组、阳性对照组吸光度。

1.3.3.3 对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基的清除能力

采用对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）评价体系[22]研究KOGM及KOGM-Se对DPPH自由基的清除作用。将2.0 mL样品溶液（质量浓度分别为1、2、4、6、8、10 mg/mL）和2.0 mL 0.16 mmol/L DPPH溶液混合均匀，于25 ℃反应15 min，在517 nm波长处测定吸光度。阳性对照组为VC，空白对照组为蒸馏水。按式（1）计算DPPH自由基清除率。式中：Aj为体积分数95%乙醇溶液代替DPPH溶液作试剂空白的吸光度。

1.4 数据分析

抗氧化实验数据采用GraphPad Prism 5.0软件作图，计算平均值，在SEM模式下计算标准偏差。核磁共振波谱数据采用DMFit 2015软件将原始数据转化成ASCII格式，采用Origin Pro 8软件作图。

2 结果与分析

2.1 KOGM-Se结构的表征

图2 KOGM-Se傅里叶变换红外光谱图Fig. 2 Fourier transform infrared spectrum of KOGM-Se

从KOGM-Se的傅里叶变换红外光谱图（图2）可以看出，3 383 cm-1处的强吸收峰为—OH的伸缩振动峰。2 929 cm-1和1 384 cm-1处的吸收峰为C—H的伸缩振动峰和变角振动峰。1 633 cm-1处出现的峰为CHO的C＝O键的伸缩振动峰。1 060～1 027 cm-1处是糖残基C—O—C和C—O—H键的伸缩振动峰。在740 cm-1处有明显的吸收峰，为亚硒酸酯特征吸收峰，说明KOGM上发生了硒化反应，且硒的存在形式为亚硒酸酯[23]。

图3 KOGM-Se和KOGM的核磁共振氢谱图Fig. 3 1H nuclear magnetic resonance spectra of KOGM-Se and KOGM

比较K O G M-S e和K O G M的核磁共振氢谱（图3），可以看出两者峰整体形态没有太大变化；δ 4.5处的峰为β-糖苷键的C1上H峰；由于化合物为寡糖，δ 3.3～δ 4.2处的峰为糖残基C2～C5上的H峰，但没有完全分开；δ 2.1处的峰为乙酰基上C—H的H峰[24]。KOGM-Se糖残基在δ 2.1处峰明显减弱，说明糖残基的修饰基团乙酰基占比减少。

图4 KOGM-Se和KOGM的核磁共振碳谱图Fig. 4 13C nuclear magnetic resonance spectra of KOGM-Se and KOGM

比较KOGM-Se和KOGM的核磁共振碳谱（图4），可以看出两者峰整体形态没有大的变化。δ 103处的峰为β-葡萄糖苷键C1的峰，δ 101处的峰为β-甘露糖苷键C1的峰；δ 71～δ 79处的峰为糖残基C2～C5的峰；δ 61左右的峰为C6的峰[24]。从图4中可以看出，两种寡糖在δ 101处的峰均高于δ 103处，说明甘露糖含量高于葡萄糖含量，这与KOGM的单糖组成中甘露糖与葡萄糖含量的比例是一致的。C2～C5的峰变化不大，δ 61左右C6的峰位移增加δ 0.1，说明亚硒酸酯化反应发生在C6位。另外，与KOGM相比，KOGM-Se在δ 175处的乙酰基峰明显减弱，也说明乙酰基比例减少。综合傅里叶变换红外光谱和核磁共振的表征结果，说明KOGM经硒化修饰后，得到的产物为KOGM亚硒酸酯。

经电感耦合等离子体质谱检测分析，KOGM-Se中硒的含量为5.9 g/kg，KOGM中未检测到硒。据报道，天然富硒土壤种植魔芋的葡甘聚糖硒含量最高为0.23 mg/kg，其制成的魔芋精粉硒含量为5 mg/kg[18]。本研究合成的KOGM-Se中硒的含量远高于天然多糖，且分子质量远小于多糖，更利于人体吸收和利用，可作为理想的有机硒食品原料。

2.2 KOGM-Se的抗氧化活性分析

图5 KOGM-Se和KOGM对羟自由基的清除作用Fig. 5 Hydroxyl radical scavenging activity of KOGM-Se and KOGM

图6 KOGM-Se和KOGM对超氧阴离子自由基的清除作用Fig. 6 Superoxide radical-scavenging activity of KOGM-Se and KOGM

清除羟自由基、超氧阴离子自由基和DPPH自由基的能力可较好地表征化合物的体外抗氧化活性。从图5～7可以看出，两种寡糖对超氧阴离子自由基没有表现出清除活性；KOGM在高质量浓度时对DPPH自由基有一定的清除活性，而KOGM-Se没有表现出清除活性。硒化后的KOGM对羟自由基表现出很好的清除活性，其清除率与质量浓度呈正相关，最高超过90%，而未硒化的KOGM没有表现出清除活性。糖类化合物硒化反应后，会带来理化性质和立体构象的变化，导致其活性的变化，某些活性指标水平提高，而有些指标却不如未硒化的多糖[25]。

图7 KOGM-Se和KOGM对DPPH自由基的清除作用Fig. 7 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical scavenging activity of KOGM-Se and KOGM

硒多糖具有清除自由基的能力，可以保护细胞敏感分子，提高机体抗氧化的能力[26]。高玉杰等[27]合成的浒苔硒多糖与浒苔多糖相比DPPH自由基的清除能力明显增强，且在1.0～10.0 mg/mL范围内具有一定的还原力。李华为等[28]研究了富硒蛹虫草硒多糖的抗氧化能力，结果发现硒多糖清除羟自由基的能力优于过氧化氢酶，且二者共存时对羟自由基的清除具有协同作用。王晓梅等[29]合成的硒化坛紫菜多糖具有清除超氧阴离子自由基和羟自由基的活性，且有一定的还原能力。宋逍等[30]研究了硒化款冬花多糖清除超氧阴离子自由基、羟自由基以及DPPH自由基的能力，发现硒多糖在5 mg/mL时清除DPPH自由基的能力强于VC，而清除超氧阴离子自由基、羟自由基的能力不如VC，但其清除能力都优于多糖，显示出了很强的抗氧化能力。商龙臣等[31]合成了硒化南瓜多糖，发现其对超氧阴离子自由基表现出很好的清除作用，但是对羟自由基的清除活性很低。上述研究的对象均为天然多糖和硒多糖，其所表现出的抗氧化活性规律与本研究的结果有所不同。

有机硒不仅在体外表现出抗氧化活性，在体内也具有很好的生物活性。研究表明硒多糖能有效提高血液中硒含量和谷胱甘肽过氧化物酶的活性，显著降低脂质过氧化产物丙二醛的含量，增加红细胞抗过氧化氢氧化损伤的能力[32]。Sheng Yu等[33]从桔梗基部分离得到硒多糖，研究了其对过氧化氢诱导的大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞氧化损伤的保护作用，发现用硒多糖预处理可减少过氧化氢损伤后PC12细胞存活率的降低，阻止膜损伤，减弱细胞内活性氧的形成，表明硒多糖可通过抑制氧化应激来减少神经元氧化损伤。Liu Min等[34]研究了菌丝体硒多糖在体内的抗氧化和抗炎作用，发现菌丝体硒多糖具有明显抗氧化作用，其通过调控相关炎症反应显著改善了肺损伤，表明菌丝体硒多糖可能是治疗肺损伤及其并发症的潜在有效候选药物。Yuan Bo等[35]采用微波辅助法合成了硒化甜土豆多糖，发现其在体外有较好的抗氧活性和还原力；体内实验表明其可有效抑制肿瘤生长（抑制率超过50%），并调节小鼠的免疫因子（白细胞介素-2、肿瘤坏死因子-α和血管内皮生长因子）水平。硒化甜土豆多糖可显著降低糖尿病大鼠体内丙二醛含量，显著增加器官中酶抗氧化剂活性和非酶抗氧化剂水平。Lian Kexun等[36]合成了硒化甘草多糖，发现其体外抗氧化活性一般，但是在体内实验中表现出很好的抗氧化活性，能够显著提高血液和肝脏中谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性，显著降低肾脏和肝脏中丙二醛的含量。

从上述研究可以看出，目前关于硒化糖的研究主要为硒多糖方面，关于寡糖的硒化和活性研究较少。本研究合成的KOGM-Se在体外表现出较好的抗氧化活性，且分子质量比多糖小很多，更利于体内的吸收和利用，推测在体内实验中会表现出更好的抗氧化活性。后续将进一步开展KOGM-Se在体内的生物活性实验。

3 结 论

本研究建立了KOGM-Se合成工艺，并对其结构进行了表征，对硒含量进行了测定。结果表明，制备的KOGM-Se为KOGM亚硒酸酯，硒化位置可能为C6位。KOGM-Se中硒的含量为5.9 g/kg，远高于富硒土壤种植魔芋提取的天然多糖（0.23 mg/kg）。KOGM-Se作为一种高硒含量有机硒化物具有较好的抗氧化活性，可作为理想的有机硒食品原料。