上海市某马场马疱疹病毒1型感染的确诊

刘 健，李 鑫，葛菲菲，杨德全，沈海潇，鞠厚斌，葛 杰，于讳茹、邓 波、王 建，赵洪进

（上海市动物疫病预防控制中心，上海 201103）

马疱疹病毒（equine herpesvirus，EHV）属于马疱疹病毒科，共有9个成员（EHV-1～EHV-9），其 中 EHV-1、EHV-3、EHV-4、EHV-8和 EHV-9属于α疱疹病毒亚科[1]。EHV-1和EHV-4又称马鼻肺炎病毒，是严重危害养马业的主要传染病病原之一，流行于全球40多个国家和地区[2]。从致病性角度来看，EHV-1主要引起妊娠马流产以及神经性疾病和呼吸系统疾病，而EHV-4主要引发呼吸系统疾病[3]。

本研究采用EHV-1和EHV-4普通分型PCR方法，对上海市某马场疑似临床病例的鼻拭子和抗凝血样品进行检测，并对阳性样品进行测序比对，最终确诊为EHV-1型感染。

1 材料与方法

1.1 样品来源

马鼻拭子样品5份、抗凝血3份，均来源于上海市某马场疑似临床症状马匹。

1.2 主要试剂

TaqDNA聚合酶：批号A4201A，购自宝生物工程（大连）公司；DNA提取试剂盒：批号MD5416-01，购自Magen生物公司。

1.3 合成引物

根据参考文献[4]合成引物。EHV-1上游引物 EHV-1-F：5'-CTTTAGCGGTGATGTGGA-3'。E H V-1下 游 引 物 E H V-1-R：5'-GTTTGTGCAAGCGATGTAGA-3'。EHV-4上 游引物 EHV-4-F：5'-GTCAACCCAGTCCGCTAA-3'；E H V-4下 游 引 物 E H V-4-R：5'-GGCATCCATCCGACATAA-3'。

1.4 反应体系和反应程序

PCR 反应体系（50 μL）：模板 10 μL，引物（20 pmol/L） 各 1 μL，10×Buffer 5 μL，TaqDNA 聚合酶 0.2 μL，加 ddH2O 补足至 50 μL。反应程序：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物于10 g/L琼脂糖凝胶上进行电泳鉴定。EHV-1目的片段大小为265 bp，EHV-4为 537 bp。

1.5 序列测定和比对

将出现特异性条带的PCR产物，送桑尼生物有限公司测序，并将序列与参考序列进行比对，确定阳性条带的病毒亚型。参考序列来源：肯塔基株（GenBank登录号AB279609）、日本株（GenBank登录号 KF644571）、英国株（GenBank 登录号AY665713和M36298）和德国株（GenBank 登录号X95377）。

2 结果

2.1 EHV-1和EHV-4扩增

以病毒DNA为模板，利用特异性引物，通过PCR方法在5号棉拭子样品（SS-5）中扩增出265 bp的特异性条带（图1），其大小与EHV-1目的片段一致，未出现EHV-4目的条带及其他非特异条带。

2.2 扩增片段核苷酸同源性分析

将阳性样品扩增序列与已知gB参考序列进行比对，获得核苷酸序列的同源性（表1）。比对结果表明，阳性样品序列与参考毒株序列同源性在95.6%～96.4%之间，可以判定阳性样品属于EHV-1型。

图1 待检样本扩增结果

表1 阳性样品SS-5与参考毒株gB序列核苷酸同源性分析结果

2.3 EHV-1遗传进化树分析

应用DNAstar分析软件，比对SS-5扩增序列与GenBank中5个已经公开的EHV-1gB序列。通过Clust-alX1.83分子生物学软件，比较分析并用MEGA3.1绘制了基因组进化树（图2）。结果显示，SS-5与其他参考株同源性关系较远。

图2 SS-5基因进化树

3 讨论

EHV-1和EHV-4具有疱疹病毒甲亚科典型的生物学特征，从而引起相应的流行病学特征，如青年马易感，但发病率低，潜伏感染的带毒马比例较高，并经常排毒，不间断传播给新的易感动物，从而导致疫病流行[5]。根据流行病学、临诊症状、流产胎儿病变，尤其是嗜酸性核内包涵体等，可对马鼻肺炎作出初步诊断[6]。但EHV-1和EHV-4感染引起的马鼻肺炎容易与其他病原导致的上呼吸道感染、流产或神经性疾病相混淆，因此不能只依赖于临床症状来诊断，还需要进行实验室检测来确诊[7-8]。本研究采集具有疑似临床症状马的鼻拭子样品和血浆样品进行EHV-1和EHV-4分型检测，发现第5号鼻拭子样品为EHV-1阳性，表明上海市马群中存在EHV-1感染，并引起了相应的临床症状。

EHV-1在我国分布较广，马匹一旦感染可终生带毒。病马和康复带毒马是本病的传染源。康复带毒马如果受断奶、运输等应激因素刺激，潜伏的EHV-1会再次被激活，导致发病[9]。本病主要通过空气传播，呼吸道是EHV-1的主要入侵门户，消化道和交配也可传染。因此，加强饲养管理和疫苗接种是预防和控制EHV-1感染的主要方法，包括严格遵守卫生防疫标准，定期对马厩进行消毒，注意饮食来源等。同时，应重点加强对妊娠母马的饲养与卫生管理，包括分群饲养、隔离检疫、小群饲养、避免应激和阳性马隔离等[10-11]。EHV-1疫苗虽然无法根除EHV-1，但可有效减少EHV-1引起的呼吸道感染症状和母马流产症状[12]，因此应定期进行EHV-1疫苗免疫。