高效液相色谱法测定小麦中黄曲霉毒素B1含量

王艳红,胡丹丹,潘雪静

(德州市陵城区检验检测中心，山东 德州 253500)

黄曲霉毒素污染是深受食品和农产品行业关注的问题，小麦等粮食作物，在湿热条件下储藏时容易受到黄曲霉污染，产生黄曲霉毒素，人和动物摄入或皮肤接触被黄曲霉毒素污染的粮食时，会引发多种中毒症状甚至死亡[1]。黄曲霉毒素主要是由黄曲霉和寄生曲霉产生的次生有毒代谢产物，是一类具有较强毒性和致癌性的二氢呋喃香豆素衍生物，其中，黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，简写为 AFTB1)的致癌性最强，是诱发恶性肿瘤原发性肝细胞癌的主要因素之一[2]。食品安全国家标准GB 2761-2017中规定黄曲霉毒素B1在小麦等谷物中最大限量为5.0 μg/kg[3]。近年来，由于全球的气候变暖，小麦等谷物被黄曲霉毒素侵害的程度及范围均呈上升趋势[4]，因此，开发快速高效的分析方法检测粮食作物中黄曲霉毒素B1对于保障粮食安全有着十分重要的意义。

常见的黄曲霉毒素B1检测方法主要为薄层色谱法(TLC)[5-6]、酶联免疫法(ELISA)[7]、高效液相色谱法(HPLC)[8-9]和液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[10-11]。薄层色谱法和酶联免疫法操作简单，但容易出现假阳性，定量效果较差，不适用为最终确证；液相色谱-串联质谱法需要配备价格昂贵的液相色谱-串联质谱仪，检测成本较高，应用受到一定限制。高效液相色谱法(荧光检测)是黄曲霉毒素B1分析最常用的分析方法，本研究在此基础上进一步优化，一方面采用了光化学衍生器进行柱后衍生，既增强了AFTB1的检测灵敏度，又避免了化学衍生过程带来的试剂污染；另一方面改进了AFTB1的提取过程和固相萃取洗脱过程，AFTB1的回收率可提升至98.3%。与传统的高效液相色谱法测定黄曲霉毒素B1相比，本方法快速高效、重现性好、检出限更低、回收率更高、有机溶剂消耗少，为后续黄曲霉毒素 B1分析检测的研究提供了有力参考，适用于小麦等粮食作物中黄曲霉毒素B1的批量检测。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄曲霉毒素B1标准品：2μg/mL，农业部环境保护科研监测；乙腈、甲醇：色谱纯，Fisher公司；黄曲霉毒素B1免疫亲和柱：3mL，北京康源泰博生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

Waters e2695高效液相色谱仪(配荧光检测器)；XDB-C18色谱柱，5μm×4.6mm×250mm；FA2004万分之一天平：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；柱后光化学衍生器：北京华安麦科生物科技有限公司；FSH-2H可调高速匀浆机：金坛区西城新锐仪器厂；TDZ5-WS离心机：长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司；氮吹仪。

1.3 方法

1.3.1 黄曲霉毒素B1标准溶液的配制

将黄曲霉毒素B1标准溶液(2μg/mL)1mL转移至10mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成浓度为200ng/mL黄曲霉毒素B1标准储备液。

分别吸取标准储备液5，25，100，250，500，1000，2000μL 至 10 mL容量瓶中，流动相定容，得到浓度点为0.1，0.5,2.0,5.0,10.0,20.0,40.0ng/mL的标准工作曲线溶液。

1.3.2 样品前处理

称取均匀的小麦试样5 g于50 mL具塞离心管中，加入乙腈-水溶液(84∶ 16,v/v)25.0 mL进行提取，涡旋混匀，10000 r/min均质3min，在10000 r/min下离心5min，取上清液备用。

取15 mL上清液加入30 mL水稀释，用玻璃纤维滤纸过滤，移取15mL稀释液，过免疫亲和柱净化，流速不超过1mL/min，确保黄曲霉毒素B1完全被吸附。用10mL水分两次淋洗免疫亲和柱以除去杂质，抽干小柱，弃去全部流出液。加入3mL甲醇洗脱样品，收集全部流出液，流出液经N2吹干，准确加入1.0 mL色谱级甲醇复溶样品，混匀30 s，过0.22μm滤膜后待测。

1.3.3 色谱条件

进样量20μL；柱温40℃；流速1mL/min；流动相：甲醇∶ 水=55∶ 45；激发波长：360nm，发射波长：440nm；分析时间为15min。

2 结果与分析

2.1 洗脱液体积的选择

文献中AFTB1经免疫亲和柱净化后，只加入1 mL甲醇进行洗脱，但研究发现，加入1 mL甲醇洗脱后上机测定，AFTB1的回收率仅为80%左右。因此考虑，1mL甲醇并不能完全洗脱免疫亲和柱中吸附的AFTB1。设计实验分3次向同一待洗脱的免疫亲和柱中加入1mL甲醇进行洗脱，每次均抽干小柱，分别收集三次洗脱液进行HPLC分析，结果发现：第一次洗脱后AFTB1的回收率为80%，第二次洗脱后AFTB1的回收率为16%，第三次洗脱后AFTB1的回收率才几乎为0。因此本文采用洗脱液体积为3mL，收集到的洗脱液经N2吹干后，再准确加入1.0 mL甲醇复溶样品，待HPLC分析。

2.2 提取溶液的选择

GB 5009.22-2016中给出了两种提取溶液：甲醇-水和乙腈-水，本文以此为突破点，分别研究了甲醇-水系列(甲醇的体积分数分别为30%、50%、70%、84%和90%)和乙腈-水系列(乙腈的体积分数分别为30%、50%、70%、84%和90%)作为提取溶液时黄曲霉毒素B1的回收情况，结果见表1。通过比较发现V(乙腈)∶ V(水)=84∶ 16作为提取溶液时提取效率最好，黄曲霉毒素B1的回收率最高，可达到98.3%，因此本文选择V(乙腈)∶ V(水)=84∶ 16作为最优提取溶液。

表1 提取液对黄曲霉毒素B1回收率影响

表1(续)

2.3 标准曲线及相关系数

按优化后的方法对已配置好的AFTB1准工作曲线溶液进行HPLC测定，以色谱峰面积为纵坐标，AFTB1含量为横坐标，绘制校正曲线(如图1)。AFTB1在0.1～40.0 ng/mL浓度范围内成线性关系，线性回归方程y=1037582x-126713，相关系数r2=0.9999，方法检出限为0.02 μg/kg(S/N=3)。

图1 AFTB1标准曲线

2.4 加标回收率和精密度

在小麦样品中分别加入3个水平的AFTB1标准品，按优化后的处理方法每个水平平行处理6次，测定样品中AFTB1浓度(图2为小麦试样色谱图，图3 为小麦试样加标色谱图)，测试结果见表1，AFTB1的回收率为92.0%～98.3%，相对标准偏差RSD<3%。

图2 小麦色谱图

图3 小麦(加标)色谱图

表2 样品中加标回收率和精密度试验结果

3 结论

本研究建立了一种固相萃取-高效液相色谱-柱后光化学衍生-荧光检测的分析方法测定小麦中黄曲霉毒素B1的含量，通过改进AFTB1的提取过程和固相萃取洗脱过程，优化了样品的前处理。在最优条件下，AFTB1在0.1～40.0 ng/mL范围内线性良好，方法检出限可达到0.02μg/kg(S/N=3)，三个水平的加标回收率在92.0%～98.3%之间，相对标准偏差RSD<3%。本研究检出限更低、回收率更高，适用性强，为小麦等粮食作物中黄曲霉毒素 B1污染情况的监测提供了准确可靠的依据。