生物炭中持久性自由基对秀丽隐杆线虫的毒性

张绪超,陈 懿,胡 蝶,赵 力,王 琳,吴 敏*



生物炭中持久性自由基对秀丽隐杆线虫的毒性

张绪超1,2,陈 懿1,2,胡 蝶1,赵 力1,2,王 琳1,2,吴 敏1,2*

(1.昆明理工大学环境科学与工程学院,云南 昆明 650500；2.云南省土壤固碳与污染控制重点实验室,云南 昆明 650500)

为了评价生物炭的使用对生态系统,尤其是对土壤无脊椎动物的毒性影响,使用模式生物秀丽隐杆线虫(,)来评估生物炭的环境风险.观察了生物炭原样、生物炭颗粒物和生物炭浸提液对线虫神经行为学评价指标(身体摆动频率、相对运动长度、排泄间隔时间、碰触反应率和化学感知行为指数)的影响;并结合生物炭的理化性质、非金属元素组成和重金属元素含量以及环境持久性自由基(EPFRs)的强度,评估生物炭对线虫的生物毒性.结果显示,EPFRs信号强的生物炭和颗粒物对秀丽隐杆线虫有一定的毒物兴奋效应,EPFRs信号微弱的浸提液无显著性影响.因此,生物炭中的EPFRs对秀丽隐杆线虫有潜在的神经毒性作用.

生物炭；持久性自由基；秀丽隐杆线虫；神经毒性；环境风险

近年来,生物炭因其可以作为土壤修复改良剂而受到越来越多的研究关注.生物炭能通过提高营养元素利用率和土壤保水性而增加农作物生产力,因而被大规模施用到土壤改良中[1-2].生物炭在热解制备过程中,不可避免地会产生大量副产物,如多环芳烃(PAHs)、重金属和环境持久性自由基(EPFRs)等[1,3-4].前人研究报道了生物炭对微生物[5-6]和植物[1]的影响,以及其中传统污染物PAHs和重金属对生物的影响[7-8],然而研究中却很少关注生物炭中新型风险物质EPFRs的影响,尤其是对土壤重要生物组成部分之一——动物的影响.已有研究发现生物炭中存在大量的EPFRs,并发现EPFRs会对种子萌发和幼苗的生长产生抑制[4].因此,亟需研究生物炭对土壤动物的影响.这将有助于生物炭在被施用到田间土壤前,对其进行有效的风险评估,从而降低其环境风险,更好地发挥其土壤修复作用.

秀丽隐杆线虫(,)作为一种食细菌类的线虫,是土壤生物多样性的重要组成部分,可以参与并提高土壤肥力和植物生产力[9-10].同时,秀丽隐杆线虫由于其繁殖快、与人类基因同源性、突变体多等众多的优点而成为一种重要的模式生物[11-13].现在,它已经被广泛应用于环境科学领域中来评估污染物的风险. Peredney等[14]尝试利用秀丽隐杆线虫评估了土壤中重金属的风险,结果表明秀丽隐杆线虫足够敏感,并有足够的生物信息和生态关联性,可以作为一个理想的生物选择来评价土壤中的污染物质.直到21世纪初美国材料与试验协会针对秀丽隐杆线虫制定了标准(E2172−01)[15]并推荐将其作为模式生物来评估土壤的风险.此后,大量研究将其作为模式生物来评价污染物在多种环境介质中的毒性作用,并发现其对神经毒性的响应比对其他毒性作用更为敏感[16-21].如,观察到两种有机溴化物混合暴露后对其有一定的神经刺激作用[16-17],量子点可能影响神经元系统的正常发育和功能[18],氧化石墨烯损伤中间神经元可能的分子信号调节路径[19-20],煤燃烧产生的颗粒物(PM2.5)可能因氧化应激而诱发对秀丽隐杆线虫的毒性作用[21].因此,本研究选取秀丽隐杆线虫为模式生物探究生物炭对土壤生物的毒性影响.

在本研究前期实验中,发现生物炭中EPFRs可能会对秀丽隐杆线虫有一定的神经毒性[22],但未直接排除PAHs和重金属等潜在有毒物质的影响.因此,本研究使用秀丽隐杆线虫来评估生物炭原样、颗粒物以及浸提液的潜在毒性,深入探索生物炭毒性作用的来源,以期为更好地了解生物炭的环境风险提供理论基础.

1 材料与方法

1.1 生物炭和颗粒物以及水浸提液的制备

水稻秸秆采自云南省昆明市呈贡区吴家营社区(24.8°N, 102.8°E),用粉碎机打碎后,过60目筛,存放于密封袋置于避光处保存.生物炭制备过程:(1)将6个100mL的坩埚置于105℃烘箱干燥2h后,在玻璃干燥器中冷却到室温;(2)每个坩埚进行编号,称重,放入不超过坩埚体积三分之二的水稻秸秆,记录质量;(3)将坩埚置于马弗炉内腔体中间,通入纯度为99.99%的氮气30min排尽空气后开始升温,使用转子流量计控制流速(100mL/min).一直保持氮气环境,升温到500℃并维持2h后,停止升温,待温度降至室温,称重.颗粒物的制备和水浸提液提取过程:将217.4mg的生物炭加入到30mL的无菌水中(此处由元素分析的结果换算成碳的浓度即4000mg/L),并设置一组平行样;置于摇床中(20℃, 200r/min)避光摇晃24h后,使用0.45μm的滤膜进行过滤,滤膜上的生物炭烘干(50℃,12h)即为颗粒物,过滤液即为浸提液,未洗的生物炭原样即为生物炭.此外,实验中对生物炭、颗粒物和浸提液3种暴露体系与食物菌液OP50混合之前和混合之后24h的pH值进行了检测,所测pH值为(5.99±0.04).同时,Khanna等[23]报道了秀丽隐杆线虫在3.1~11.9的pH值范围内的致死率无显著性差异.

1.2 生物炭的元素分析和基本理化性质测定

生物炭的非金属元素(C、N、H、S、O)使用元素分析仪(vario MICRO cube, Elementar, 德国)检测,结果用质量比表示.生物炭的金属元素和类金属元素使用ICP-MS(PerkinElmer NexION350, 美国)进行分析,步骤如下:将0.100g生物炭加入到装有5mL浓硝酸和5mL氢氟酸的消解管中或1mL浸提液加入到装有7mL浓硝酸和2mL过氧化氢的消解管中,把消解管放入智能温压双控微波消解仪(奥普勒MD8h-20H, 成都),在180℃条件下消解45min,消解液冷却至室温后进入ICP-MS仪器检测,颗粒物的这些元素含量通过差量法获得.PAHs检测方法参考中国生态环境部颁发的标准《土壤和沉积物多环芳烃的测定气相色谱-质谱法》(HJ 805-2016),使用20.0g生物炭进行实验[24].

1.3 持久性自由基信号分析

将2mg左右的生物炭或颗粒物或50μL水浸提液装进石英毛细管(内径1mm,长度125mm)中,毛细管末端使用真空油脂封口,再将毛细管置于EPR (Bruker X-band A300-6/1,美国)的共振腔中,检测EPR信号,调制频率100kHz,微波频率9.2~9.9GHz,调制幅度1.00G,扫描宽度100G,微波功率31dB (0.131mW).测到的强度使用质量(mg)进行标准化.

1.4 秀丽隐杆线虫和菌株的培养

所有实验使用野生型N2秀丽隐杆线虫,同步化后的虫卵在接种有大肠杆菌OP50的96mm的线虫固体生长培养基(NGM)上培养到L4时期后,进行暴露实验.和OP50来自明尼苏达大学的线虫遗传学中心(CGC).

1.5 毒性暴露条件

参考生物炭田间使用比例和前人毒性研究结果[4,22],每个NGM平板上依次加入0,0.5,1,2,4mg的生物炭,相当于暴露时碳的浓度是0,250,500,1000, 2000mg/L,并在培养基表面只加1mL的OP50,待菌液风干后开始实验.对于颗粒物加入与生物炭相同的质量,对于浸提液使用含有OP50的K-medium进行稀释得到.神经行为学实验前,将30条同步化后的L4时期的线虫放到暴露平板中,置于20℃培养箱中避光培养24h,每个浓度至少重复3次实验.

1.6 神经行为学实验

大量研究表明,神经行为学指标可以很好的反映出污染物的神经毒性,而且比较快速,易于操作和实现[16,25].本研究的神经行为学实验方法参考Lieke等[22]的研究方法.即,身体摆动频率次数是指60s内线虫向前做类似正弦曲线弯曲运动时的拐点数;相对运动长度是指在20s内线虫运动的轨迹长度与其自身长度的比值;排泄间隔是指线虫每2次排泄行为之间的时间间隔;机械感知行为是指线虫应对头发丝碰触的反应,若向后退缩,记为一次反应;化学感知行为指数()是指线虫对于氯化钠(NaCl)的感知能力,并按式(1)进行计算,通常认为线虫趋于爬向有NaCl的地方,是因为NaCl在其生长环境中,当线虫感知到NaCl时,会把NaCl和食物联系在一起,如果神经受到损伤,会显著降低.所有行为学实验通过体式显微镜(Nikon SMZ 1500,日本)或显微镜(Nikon Eclipse E100,日本)观察、拍照分析得到.

式中:N和C分别指以NaCl点和以Control点为中心的半径为1.5cm的圆内线虫的个数;T是放入开始点S点的线虫的总个数.S点位于等腰三角形(腰长3cm,底边长4cm)的顶角所在点的位置,NaCl点和Control点分别位于两侧底角所在点的位置.本文中在S点放入30条线虫并置于20℃培养箱1h后,开始计算相应点的线虫数目.

1.7 数据分析

实验数据以mean ± SEM表示,数据使用Microsoft Office Excel 2016进行前期处理,图和单因素方差分析(Holm-Sidak method)由Graphpad Prism 7 完成.*表示<0.05,**表示<0.01.

2 结果与讨论

2.1 生物炭的元素组成和基本理化性质

本实验条件下生物炭的产率为(29.30±2.29)% (表1),通常,生物质热解时生物炭的产率会随着温度升高而降低,这是由于大量脱水、脱氢反应的发生.这与Wu等[26]报道的结果(38.6%)有一定差异,而文献中玉米秸秆和松木在500℃的产率分别是25.43%和24.12%,导致这一现象差异的可能原因之一是生物质来源不同,如不同木质素和纤维素含量的玉米秸秆(CN500)和松木屑(PW500)[27],还有可能是热解工艺不同,如升温程序和载气流速[26,28].

生物炭(R500)的元素组成和原子比见表1,其中生物炭的C含量达到55.20%,H和O含量较低.H/C和O/C的比值分别是0.47和0.12,与文献中相同生物质和相同温度的生物炭(表1)差别不大[26].对比不同温度的H/C、O/C和(N+O)C发现,这些比值会随着温度升高而降低,这可能与芳香环结构的增加有关[26-27].

表1 生物炭的非金属元素构成

注: CN500表示500℃水稻生物炭,PW500表示500℃松木屑生物炭[27]; R300-2:“R”表示水稻秸秆生物炭,“300”表示热解温度是300℃,“2”表示热解时间是2h,其他数据以此类推[26].“—”表示原文没有该项数据.

生物炭中的重金属元素含量会因其原生质的不同而有所差异.本实验使用的生物炭中Fe和Mn含量分别为204.5,218.2μg/g(表2),比一般生物炭中含量偏高,这可能与实验所采用的水稻秸秆生产于云南地区有关,云南地区主要以红壤为主,红壤中含有较多的铁锰化合物.参考中国生态环境部颁布的《土壤环境质量标准农田地土壤污染风险管控标准(试行)》(GB 15618-2018)[28]中农用地土壤污染风险筛选值的基本项目,即As(20mg/kg)、Cd (0.3mg/kg)、Cu(50mg/kg)、Pb(70mg/kg)、Hg(0.5mg/ kg)、Ni(60mg/kg)、Zn(200mg/kg)(标注的是较为严格的风险筛选值),对比发现:生物炭和浸提液中的金属元素和类金属元素含量均低于基本项目中的风险筛选值.值得注意的是,参考《土壤和沉积物多环芳烃的测定气相色谱-质谱法》(HJ 805-2016)[24],在生物炭中未检测到PAHs,可能其浓度低于仪器的检测限.

生物炭性质的差异可以导致不同的反应活性和吸附性能,如非金属元素构成、金属元素含量以及比表面积等.这些差异对于生物毒性的影响是未知的.

表2 生物炭和浸提液中的金属和类金属元素含量(μg/g)

注: “—”表示没有检测到该项值.

2.2 不同浓度生物炭对线虫的毒性影响

自主行为是神经行为学中的常见评价指标,可以反映出有毒物质对于线虫神经行为的基本影响以及线虫的行为能力和损伤情况[29].感知行为是线虫对于来自生存环境中物理或化学或其他刺激作用的反应,可以体现出线虫特定感知神经元的变化[29].

在自然界中,运动行为(Locomotion, 即身体摆动频率和相对运动长度)能力是线虫生存的必备能力,可以帮助线虫获取食物和躲避捕食者以及逃离不利环境[25].图1显示,在生物炭低浓度(250mg/L)暴露时,线虫身体摆动频率从49次/min提高到53次/ min(图1(a)),相对运动长度从4.51/20s增加到4.89/ 20s(图1(b)),而在高浓度时(2000mg/L)2个指标依次减小到42次/min(=0.0003)和3.7/20s(=0.0031).暴露于生物炭中的线虫,运动行为表现为低浓度时运动活力增加,高浓度时被抑制.

排泄间隔时间反映的是线虫肠道内食物的消化时间长短,通常,时间变长时,线虫对于自身能量的需求也就减少,也有可能是神经的损伤.排泄间隔时间在生物炭低于500mg/L浓度时有一定降低的趋势但是无显著影响,在高浓度时(1000,2000mg/L)被延长到77s左右(图1(c),=0.0020和=0.0004).在低浓度时,排泄间隔时间缩短可能是因为线虫接触一些能被它感知的有毒物质时出于对自身保护的反应[25,30],高浓度时,神经被损伤导致时间延长.Lieke等[25]在研究和比较天然水体产物中的二溴乙酸(DBAA)和人工合成外源性化合物的四溴双酚-A(TBBP-A)对线虫排泄间隔时间的影响时,也观察到了类似的结果,同时指出GABAergic神经元AVL和DVB的调节起到了重要作用.

机械感知行为能力是线虫对于其外部环境和捕食者以及食物等的反应,通常,碰触反应率降低时,意味着线虫的生存能力会因缺少足够的食物来源或者适宜的环境而降低[25].图1(d)中线虫的碰触反应率总体上没有太大的变化,有趣的是即使未添加任何生物炭或颗粒物或浸提液,碰触反应率也只有97%,但在500mg/L时提高了约3%,在高浓度的时候(2000mg/L)降低了约3%.化学感知行为能力可以反映出线虫对于食物和不利环境的感知能力,通常,化学感知行为指数降低时,线虫可能面临食物短缺的威胁,也会遭受到有毒物质的伤害[17,25].图1(e)中线虫的化学感知行为指数在低于浓度1000mg/L时有一定升高,高浓度时(2000mg/L)被抑制,并且误差较大.机械感知行为和化学感知行为通过感觉神经元ASH接受外界的刺激[31],然后信号由谷氨酸能神经元ASE、AWC和ASH进行传递,这3个神经元调节线虫感知钠和氯化物的能力[25,32].当有毒化学物质引起转录减少的时候,化学感知行为指数有可能也会因此降低[33].此外,排泄间隔时间的减少和碰触反应率的降低都有可能会引起线虫寿命的缩短[25].

暴露于颗粒物后的线虫,与暴露于生物炭后的线虫的结果相似,运动行为表现为低浓度时运动活力增强,高浓度时被抑制.只是化学感知行为指数呈现出随着浓度升高而降低的趋势,说明颗粒物对于化学感知行为有潜在的损伤能力.暴露于浸提液后的线虫,与生物炭和颗粒物表现出明显的区别.总体上来看,线虫的头部摆动频率、相对运动长度、碰触反应率随浓度均变化不大,对于排泄间隔时间高浓度(2000mg/L)只增加了3s,化学感知行为指数的波动也不大.说明浸提液中的潜在有毒物质对线虫的神经行为能力影响不是很大.

生物炭与颗粒物对线虫运动行为的这种低浓度促进高浓度抑制(即呈现出神经毒性)的现象,称之为毒物兴奋效应.毒物兴奋效应通常是指某一物质在低浓度时对生命体没有什么损害甚至有一定刺激和有益的作用,而在高浓度时有害的现象[22,34-35].目前还没有一个统一的机理来解释毒物兴奋效应,但是它被发现广泛存在于生态系统中[34]. Steinberg等[36]通过研究自然界中外源性化合物对秀丽隐杆线虫的影响后,发现转录反应可能是诱发毒物兴奋效应的原因之一.

a.头部摆动频率;b.相对运动长度;c.排泄间隔时间;d.碰触反应率;e.化学感知行为

2.3 持久性自由基及其对线虫的神经毒性影响

生物炭中的EPR信号强度达到了5.6×105mg-1,洗过后的生物炭也就是颗粒物其强度与生物炭仍然维持在一个数量级上,保持在3.7×105mg-1,而浸提液只有1.2×103mg-1,与空白管1.1×103mg-1基本一样,见图2.g-因子(g-Factor)是EPR仪器中用来分析EPFRs类型的值,通常g-Factor的数值小于2.0030时,EPFRs属于以碳为中心的自由基,如木材燃烧过程产生的的自由基[37];g-Factor大于2.0040时,则属于典型的以氧为中心的自由基,如煤炭中的有机自由基[38-39];g- Factor介于2.0030~2.0040之间时,则可能是以碳和氧为中心的混合自由基,如公路上收集的颗粒物中的半醌类自由基[40].本实验中生物炭和颗粒物的g-Factor分别是2.00318和2.00320,介于2.0030~ 2.0040之间属于以碳和以氧为中心的混合自由基,这与Liao等[4]和Lieke等[22]的研究结果基本一致.

研究发现,当水稻秸秆热解温度从200℃升到500℃时,生物炭中的EPFRs强度随着温度升高而快速增强,而当温度从500℃升到1000℃时,EPFRs强度则随温度升高而迅速降低[4].因此,本实验选用EPFRs强度最强时的温度500℃生物炭作为实验材料.从图1中可以看出,生物炭和颗粒物对线虫的神经行为能力影响趋势基本一致,而浸提液对线虫则基本没有影响.对比生物炭、颗粒物和浸提液三者之间的EPFRs信号发现(图2),生物炭和颗粒物的EPFRs强度保持在一个数量级上,而浸提液则基本上与空白对照的强度一样,因此,本文推测生物炭和颗粒物对线虫的神经毒性来源于EPFRs的影响.

图2 生物炭、颗粒物和浸提液中的持久性自由基信号图

生物炭中含有一些潜在有毒物质(金属、类金属元素和PAHs),若这些元素超过一定量或长期暴露后,同样会对线虫有一定的损伤,但是本实验中金属与类金属元素含量(表2)远远低于阈值[14,41];此外,生物炭在高温热解过程中可能会产生PAHs等致癌物质,但是本实验并未检测到生物炭中PAHs的存在,这可能与水稻秸秆生物炭中的PAHs含量较少以及生物炭的强吸附性能有关.Hale等[7]研究了50种不同来源和温度的生物炭后,发现慢速热解的生物炭中16种PAHs的质量浓度总和(SPAHs)最高的也只有3.27μg/g,这个浓度是远低于土壤环境质量标准中SPAHs浓度的.本实验使用浸提液进行毒性实验的结果也说明潜在有毒物质对线虫影响不大.所以,本研究生物炭中的金属、类金属元素和PAHs对线虫造成影响的可能性也非常小.因此,线虫的神经毒性极有可能来源于生物炭中EPFRs的暴露.

生物炭中的EPFRs不仅稳定时间长久,能长达1a以上[4,22],而且实验表明水稻秸秆等生物炭可以在液相环境中刺激活性氧(ROS)的产生[4,42],从而损伤种子萌发,降低种子发芽率,抑制幼苗根长和茎长[4]. EPFRs不仅可以在体外诱导产生ROS[43],而且可以随着环境介质进入到体内,刺激体内ROS的形成[44-45]. ROS的性质非常活泼,能够攻击和损伤包含脂质、蛋白质和多聚核苷酸在内的几乎所有生物大分子,造成氧化应激损伤[46],进而破环机体正常身体功能,引发神经退行性病等疾病.氧化应激可以损伤神经元,因而氧化应激在阿兹海默症和帕金森病等病中被看作是一个重要原因[46].因此,生物炭和颗粒物中大分子断裂形成的EPFRs可能是引发线虫神经毒性的主要原因.未来的工作可以尝试使用不同温度和不同生物质来源的生物炭(含有不同强度的EPFRs)来进行毒性实验,以进一步证实EPFRs的神经毒性作用.

3 结论

3.1 观察了生物炭、颗粒物和浸提液对秀丽隐杆线虫的5个神经行为学指标后发现,生物炭和颗粒物对秀丽隐杆线虫有毒物兴奋效应,而浸提液的影响基本可以忽略.

3.2 生物炭的EPFRs强度为5.6×105,颗粒物的强度为3.7×105;浸提液的强度远低于生物炭和颗粒物;且生物炭和颗粒物的g-Factor介于2.0030~2.0040之间,属于以碳和氧为中心的混合自由基.

3.3 生物炭中潜在有毒物质(金属元素和PAHs)的含量远低于国家标准,因此EPFRs可能是引起毒性的主要原因.

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Neurotoxic effect of environmental persistent free radicals in rice biochar to

ZHANG Xu-chao1,2, CHEN Yi1,2, HU Die1, ZHAO Li1,2, WANG Lin1,2, WU Min1,2*

(1.Faculty of Environmental Science and Engineering, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650500, China；2.Yunnan Provincial Key Lab of Carbon Sequestration and Pollution Control in Soils, Kunming 650500, China)., 2019,39(6)：2644~2651

As an effective soil amendment, biochars have attracted increasing research attention, while their environmental risks have not been fully explored. Studies on the effects of biochars on ecosystem, especially on soil invertebrates, are still scarce. The model organism,(, nematode), was used to assess the potential neurotoxicity of biochar. The neurobehaviors of, including their body bends, relative move length, defecation, touch response and chemical index, were investigated after 24h-exposed in biochars, the washed biochars and biochar supernatants. The contents of metallic and non-metallic elements, biochar physicochemical properties and the environmentally persistent free radicals (EPFRs) were characterized. The results showed a hormesis behavior ofwhen exposed in biochar particles with high EPFRs intensity. No significant effect towas observed when exposed in supernatants. Compared to the other endogenous pollutants in biochars, EPFRs have a potential neurotoxic effects to nematodes. This study provides a new angle to assess the potential environmental risks of biochar application.

biochar；persistent free radicals；；neurotoxicity；environmental risk

X503.22,R994.6

A

1000-6923(2019)06-2644-08

张绪超(1994-),男,安徽六安人,昆明理工大学硕士研究生,主要研究方向为持久性自由基的环境风险.发表论文3篇.

2018-11-22

国家自然科学基金资助项目(41663013);国家自然科学基金资助重点项目(U1602231);云南省重点研发计划资助项目(2018BC004)

*责任作者, 教授, minwup@hotmail.com