葡萄籽油对甲巯咪唑诱导甲状腺功能减退小鼠的影响*

陈则华，肖凌云，刘宏，朱艳红，万芸

(1.华中科技大学无限极现代制剂联合实验室，武汉 430075；2.国家纳米药物工程技术研究中心，武汉 430075)

甲状腺功能减退症(甲减)是临床上常见的内分泌疾病，是由各种原因引起甲状腺激素合成、分泌及生物效应不足引起的一种全身代谢减低综合征[1]。甲减发生原因复杂，与遗传、环境等诸多因素有关，其中甲状腺炎症(包括免疫反应、病毒感染等)是重要的诱因之一[2]。研究显示，细胞因子可调节甲状腺细胞的增殖，参与甲状腺疾病的免疫紊乱，影响甲状腺细胞的多种功能活动[3]。

目前有多种动物造模方法模拟甲减症状，常用硫脲类药物包括丙硫氧嘧啶(propylthiouracil，PTU)和甲巯咪唑(methimazole)诱发，该法尤其适用于甲状腺激素作用原理、药物药理作用等研究[4-5]。研究发现葡萄籽油含有丰富的维生素和矿物质，具有延缓衰老，抵抗体内自由基，抗氧化，预防高血压、动脉硬化及心脏病，营养脑神经细胞，调节植物神经等功效[6-7]。笔者在本研究通过甲巯咪唑灌胃的方法建立甲减小鼠模型，采用葡萄籽油进行干预，初步探讨葡萄籽油对甲减小鼠的保护作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 健康4～6周龄无特定病原体(SPF)级BALB/c雌性小鼠24只，体质量14～16 g，购于湖北省实验动物研究中心。动物合格证号：42000600020792，实验动物生产许可证号：SCXK(鄂)2015-0018。

1.2药品与试剂 甲巯咪唑片(德国默克公司生产，批号：212940)；葡萄籽油(中国农科院武汉油料所提取，葡萄籽经筛选、脱壳、粉碎后用压榨法提取)；聚山梨酯80(Biosharp 公司，批号：0442)；固体石蜡(德国Leica仪器有限公司，批号：1506173)；苏木精染色液、伊红染色液(珠海贝索生物技术有限公司)；多因子酶联免疫吸附测定(ELISA)芯片(武汉研锦生物科技有限公司)。

1.3仪器与设备 生物组织智能脱水机(型号：HD-300，湖北慧达仪器有限公司)；生物组织自动包埋机(型号：HD-310，湖北慧达仪器有限公司)；摊片拷片机(型号：HD-330，湖北慧达仪器有限公司)；半自动切片机(型号：RM2235，德国Leica公司)；电子天平(型号：EK3820，广东香山衡器集团股份有限公司)；冷冻离心机(型号：H2050R，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；超声机(型号：KQ-225B，昆山超声仪器制造有限公司)；倒置显微镜(型号：DM3000，德国Leica公司)；超纯水系统(型号：NW30VF，Heal Force公司)。

1.4动物分组、模型制备及给药方法 小鼠适应性喂养1周后，按体质量随机将小鼠分为正常对照组、模型对照组和葡萄籽油组，每组8只。然后将甲巯咪唑片用研磨棒碾碎后溶于0.9%氯化钠溶液中制成10 mg·mL-1的混悬液，灌胃剂量为100 μL·(20 g)-1，剂量换算参照文献[8]。 模型对照组和葡萄籽油组连续用甲巯咪唑灌胃4周，正常对照组予等量0.9%氯化钠溶液灌胃。从第5周开始灌胃葡萄籽油，葡萄籽油的人体推荐剂量为50 mg·kg-1·d-1，使用人体推荐剂量的20倍即1 mg·kg-1·d-1作为小鼠灌胃剂量，然后将葡萄籽油用2%聚山梨酯80稀释，正常对照组和模型对照组给相应体积2%聚山梨酯80，连续灌胃至第8周实验结束。每周根据体质量换算调整给药剂量。

1.5观察指标 采用摘眼球法取血，处死，室温静置2 h后924×g离心20 min，收集血清，然后分装于-20 ℃保存。取甲状腺组织摄像后放入4%多聚甲醛中固定，取脾脏和胸腺，用0.9%氯化钠溶液清理干净组织，滤纸吸干后用电子天平称定质量，然后根据体质量计算胸腺、脾脏指数。脏器指数(%)=脏器质量(g)/小鼠体质量(g)×100% 。取4%多聚甲醛固定好的甲状腺组织，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，进行石蜡包埋。血清游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)、游离甲状腺素(FT4)的含量由湖北省中医院核医学科采用化学发光法进行检测；血清细胞因子采用定制的多因子ELISA芯片进行检测。

2 结果

2.1葡萄籽油对甲减小鼠体质量的影响 甲巯咪唑连续灌胃8周后，正常对照组小鼠体质量为(23.54±1.06)g，模型对照组为(20.80±1.32) g，葡萄籽油组为(20.28±0.82) g，模型对照组小鼠体质量较正常对照组显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)，且小鼠出现少动嗜睡，畏寒蜷卧、弓背、喜聚堆，大便稀，竖毛、体毛枯疏无光泽且易脱落等现象。与模型对照组比较，葡萄籽油组小鼠体质量差异无统计学意义，但小鼠体毛逐渐恢复光泽，活动度和抵抗力均有所增加。

2.2葡萄籽油对甲减小鼠脾和胸腺的影响 胸腺和脾脏是重要的免疫器官，其脏器指数可在一定程度上反映机体免疫功能的强弱。表1结果显示，与正常对照组比较，模型对照组小鼠脾质量、脾指数、胸腺质量和胸腺指数均差异无统计学意义(P>0.05)，但模型对照组胸腺指数有降低趋势。葡萄籽油干预后小鼠脾质量较模型对照组显著降低(P<0.05)。

表1 3组小鼠脾质量、脾指数、胸腺质量和胸腺指数比较

组别脾质量/g脾指数/(0.01 g/g)正常对照组0.089±0.0070.441±0.041模型对照组0.088±0.0050.456±0.030葡萄籽油组0.078±0.005∗10.424±0.028组别胸腺质量/g胸腺指数/(0.01 g/g)正常对照组0.033±0.0040.162±0.020模型对照组0.029±0.0050.148±0.024葡萄籽油组0.030±0.0080.162±0.047

与模型对照组比较，*1P<0.05

Compared with model control group，*1P<0.05

2.3葡萄籽油对甲减小鼠血清甲状腺功能的影响 图1结果显示，模型对照组小鼠血清FT4含量较正常对照组显著下降(P<0.05)，葡萄籽油干预后FT4含量显著升高(P<0.05)，模型对照组FT3和血清促甲状腺激素(TSH)的含量与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，葡萄籽油干预后FT3含量较模型对照组显著升高(P<0.05)。

2.4葡萄籽油对甲减小鼠大体观及组织形态学的影响 甲状腺大体观和HE染色结果可以发现正常对照组小鼠甲状腺呈深红色(图2)，镜下可见较大的滤泡均匀分布，为卵圆形或不规则形。滤泡上皮为单层立方上皮，细胞呈柱状，核圆。而模型对照组小鼠甲状腺外观明显肿大，镜下甲状腺组织增生，滤泡变小、呈结节状大小不一分布，腔内胶样物质减少，甚至消失。葡萄籽油组甲状腺组织结构较清晰，增生较模型对照组显著减轻，甲状腺滤泡为柱状或低柱状上皮，滤泡腔内有较多均一胶质。

2.5葡萄籽油对甲减小鼠血清IL-1β、IL-2和INF-γ的影响 与正常对照组比较，模型对照组小鼠血清炎症因子IL-1β、IL-2和INF-γ的含量显著升高(P<0.05)，葡萄籽油干预4周后，小鼠血清IL-1β和IL-2的表达水平显著降低(P<0.05)，见图3。

3 讨论

大量研究发现葡萄籽油具有预防高血压、防止血栓形成，抗氧化、延缓衰老，清除沉积血管胆固醇、防治冠心病等功效，但笔者尚未见到关于改善甲状腺功能方面的研究报道[9]。

甲状腺功能的改变可引起细胞调节因子的紊乱，而细胞因子是介导免疫反应的重要调节因子，它和自身免疫性甲状腺疾病的免疫病理生理过程密切相关，细胞因子不仅参与形成甲状腺的免疫紊乱，而且影响着甲状腺细胞的多种功能活动[10]。甲减患者细胞因子水平能够导致患者出现异常的甲状腺激素合成及分泌，同时还能够造成患者的甲状腺功能紊乱，主要通过影响滤泡上皮细胞功能的途径产生作用。本研究发现，葡萄籽油可以显著提高甲状腺减退小鼠FT3和FT4的含量(P<0.05)，表明其对甲状腺功能减退小鼠具有一定的保护作用。为了进一步研究其可能的保护作用机制，笔者检测了细胞因子的表达水平。

A.正常对照组B.模型对照组；C.葡萄籽油组；与模型对照组比较，*1P<0.05；与正常对照组比较，*2P<0.05

A.normal control group；B.model control group；C.grape seed oil group； Compared with model control group，*1P<0.05；Compared with normal control group，*2P<0.05

图2 3组小鼠甲状腺大体观及组织病理学(HE，×200)

Fig.2Morphologicalobservationandhistopathologyofthyroidinthreegroupsofmice(HE，×200)

A.正常对照组B.模型对照组；C.葡萄籽油组；与正常对照组比较，*1P<0.05；与模型对照组比较，*1P<0.05

A.normal control group；B.model control group；C.grape seed oil group； Compared with normal control group，*1P<0.05；Compared with model control group，*2P<0.05

临床研究发现甲减患者血清IL-1、IL-2、IL-6等细胞因子的表达发生显著变化[11-13]。IL-1由活化的单核-巨噬细胞产生，以自分泌方式作用于巨噬细胞本身，诱导其上调MHC-Ⅱ和各种粘附分子的表达水平；促使Th细胞活化，启动免疫应答；作为重要的炎症因子参与各种急、慢性炎症反应。IL-2来源于活化的T淋巴细胞。其效应细胞是诱导活化T细胞及胸腺细胞，诱导T细胞产生淋巴因子，还参与机体的免疫应答、细胞分化，调控造血等多种生理及病理过程[14]。本研究结果发现，甲减模型小鼠血清IL-1β和IL-2的含量显著升高，其可能通过参与机体炎症反应引起免疫应答来促进甲减疾病的发生发展过程。葡萄籽油干预后，IL-1β和IL-2的表达显著降低，表明其可能通过调控IL-1β和IL-2的表达起到一定的保护作用。