PD-L1基因多态性对接受卡培他滨辅助化疗结直肠癌患者的生存期影响

张 宇，王 敏，侯艳华，张俊杰

0 引 言

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）在我国每年新发病例约为37.5万，死亡病例约为19.1万［1］。西妥昔单抗显著降低CRC患者进展风险［2］。贝伐珠单抗和瑞戈非尼为患者带来生存获益［3］。Pembrolizumab为微卫星高度不稳定（MSI-H）的患者带来新的治疗选择［4］。Ⅲ期结肠癌推荐3个月的化疗时长［5］。卡培他滨的辅助化疗方案降低了CRC患者的术后复发风险［6］。免疫治疗领域的程序性死亡配体1（Programmed death-ligand 1，PD-L1）是近年来最热门的基因，也是免疫治疗药物的重要的生物标志物之一［7-8］。该基因编码的蛋白主要表达在肿瘤细胞表面通过和激活的T细胞表面的PD-1结合后，抑制T细胞活性，引起T细胞凋亡，从而实现肿瘤细胞的免疫逃逸［9］。PD-L1的表达和患者预后关系目前结论尚不统一［10］。

PD-L1基因位于染色体9p24.1，包含8个外显子。PD-L1的表达具有个体差异［11］。先前的研究结果提示，在肝癌患者中PD-L1基因的多态性位点和肝癌的易感性和预后均显著相关［12］。然而，目前在辅助化疗方面缺乏PD-L1基因遗传变异和预后的关联研究。因此，本研究旨在评估PD-L1基因901T＞C位点对接受卡培他滨为基础辅助化疗的CRC患者的无疾病生存期（disease free survival，DFS）和总生存期（overall survival，OS）的影响。

1 资料与方法

1.1 研究对象回顾性分析2010年1月至2017年12月郑州人民医院普外科行手术切除治疗的CRC患者。纳入标准：①年龄18～80岁，东部肿瘤协作组（Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG）评分0～2分，心功能正常（左心室射血分数＞50%），肾功能正常（肌酐≤1.5 ULN），骨髓功能正常（中性粒细胞计数≥1.5×109/L，血小板计数≥100×109/L，血红蛋白≥9 g/dL）；②病理诊断为CRC，且接受手术切除治疗；③预期寿命≥3个月；④接受卡培他滨为基础辅助化疗；⑤有辅助化疗前外周血标本可供检测PD-L1基因遗传变异。排除标准：①患有家族性腺瘤性息肉病；②患有其他遗传性CRC综合征。本组最终纳入研究患者265例。本研究得到医院伦理委员会的批准（伦理批号：ZZRMYY-100025-3）。

接受卡培他滨为基础的辅助化疗，具体用法用量为术后3～4周，卡培他滨1000～1250 mg/m2，2 次/d，第1～14天，每21天为1个周期。奥沙利铂，80～130 mg/m2，静脉滴注，第1天。辅助化疗结合患者情况6～8个周期。根据治疗过程中出现的血液学或非血液学毒性调整相应的给药剂量，发生可能威胁生命的毒性反应时中止治疗。

1.2 血液样本收集DNA提取及基因分型每位入组研究的患者在接受辅助化疗前收集外周血样本4 mL，用苯酚氯仿法提取基因组DNA，之后于-20℃保存。对于PD-L1基因多态性分析，本研究纳入了经过NCBI数据库查阅在中国人群中突变频率＞10%的 3个标记多态性位点（901T＞C、-1813G＞C和-1457T＞A）。设计901T＞C（rs2297136）位点的上下游PCR引物，对该位点及附近的DNA片段进行扩增，上游引物为：5′-GCTCCCTGTTTGACTCCATC-3′，下游引物为：5′-TTTTTCCCCAGACCACTTCC-3′，产物片段为274bp，用TɑqI内切酶通过限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCR-RFLP）方法对该位点进行基因分型。通过条带大小判断该位点的基因型：TT型1条274 bp条带；TC型3条条带：1条274 bp条带、1条105 bp条带、1条169 bp条带；CC型2条条带：1条105 bp条带、1条169 bp条带。部分样本的分型结果通过直接测序的方法进行验证。

1.3 组织样本收集及PD-L1基因mRNA表达分析纳入研究的部分患者在手术过程中收集被切除的CRC癌组织标本，最终纳入89例癌组织标本，液氮保存。之后用Trizol试剂进行RNA提取，采用上海罗氏real-time PCR仪器进行PD-L1基因mRNA表达实验，PD-L1基因的上游引物为：5′-CTTCCCGAGGCTCCGCACCA-3′，下游引物为：5′-GCCCCGATGAACCCCTAAAC-3′。实时定量PCR反应体系如下：SYBN Premix Ex Tag 溶液10 μL，PD-L1基因上游引物（20 μmol/L）0.2 μL，PD-L1基因下游引物（20 μmol/L）0.2 μL，dd H2O 7.6 μL，cDNA2 μL，反应体系总计20 μL，GAPDHmRNA表达用作内参。PD-L1基因mRNA用相对定量法2-△△Ct进行计算。

1.4 统计学分析采用SPSS 19.0进行分析。χ2检验分析多态性位点基因分型是否符合哈迪温伯格平衡。在基线临床资料当中，离散型的变量和901T＞C位点不同基因型的分布采用χ2检验或Fisher精确检验。连续型的变量和901T＞C位点不同基因型的分析采用非参的Mann-Whitney U检验。

通过Stata绘制Kaplan-Meier曲线比较不同基因型患者DFS和OS的差异，组间差异采用对数秩检验进行比较。DFS的计算设为从手术开始到患者出现疾病复发或任何原因出现的死亡或最后一次随访结束；OS的计算设为手术开始到患者因各种原因出现的死亡日期或最后一次随访结束日期。多变量分析时，为进一步校正其他混杂因素的影响，采用Cox风险比例模型，将可能影响OS的风险因素如年龄、性别、ECOG评分、病理分期以及901T＞C位点纳入该模型，用后退法筛选和校正潜在的混杂变量。以P≤0.05为有统计学意义。

2 结 果

2.1 入组患者基线临床资料901T＞C、-1813G＞C和-1457T＞A 3个位点中，仅901T＞C位点在分析中发现了显著的临床意义。后期分析主要针对901T＞C位点开展。901T＞C位点的基因分型结果显示，TT型185例（69.81%）、TC型72例（27.17%）、CC型8例（3.02%），最小等位基因频率为0.17，3种基因型分布频率符合哈迪温伯格平衡（P=0.758）。后期分析中将TC和CC基因型患者合并。该位点不同基因型患者在基线临床资料中的分布基本均衡。见表1。

2.2 PD-L1基因901T＞C位点对预后的影响本组患者随访0.6～7.5年，中位随访时间为5.45年。纳入研究的265例患者均可评价疗效，整体人群的中位DFS为4.6年（95%CI：3.83～5.35），中位OS为6.5年（95%CI：5.74～7.27）。

将TC和CC基因型患者合并后，共计80例。单因素分析结果显示，野生型TT基因型患者和TC/CC基因型患者中位DFS分别为4.8和3.5年，差异有统计学意义（P=0.001）。见图1。2种基因型患者的中位OS分别为6.7和4.7年，差异有统计学意义（P＜0.001），见图2。经多变量校正901T＞C位点对OS独立的影响仍均有统计学意义（OR=1.89，P=0.006）。Cox分析结果显示，年龄（OR=1.42，P=0.025）、ECOG评分（OR=2.21，P=0.005）和病理分期（OR=2.98，P＜0.001）为独立影响因素。

图1 PD-L1基因901T＞C位点不同基因型CRC患者的无疾病生存期曲线对比Figure 1 Disease-free survival of the colorectal cancer patients with different 901T＞C genotypes of the PD-L1 gene

表1 265例CRC患者的基线临床资料及901T＞C位点基因型分布比较Table 1 Baseline characteristics and 901T＞C genotypes of the 265 patients with colorectal cancer

图2 PD-L1基因901T＞C位点不同基因型CRC患者的总生存期曲线对比Figure 2 Overall survival of the colorectal cancer patients withdifferent901T＞CgenotypesofthePD-L1gene

2.3 PD-L1基因901T＞C位点对mRNA表达的影响89例癌组织标本的901T＞C位点基因分型结果显示，TT型62例、TC型23例、CC型4例，3种基因型分布频率同样符合哈迪温伯格平衡（P=0.338）。另外，89例患者的外周血标本和癌组织标本的901T＞C位点基因分型结果的吻合率为100%。CC型患者相对较少，同样将TC型和CC型患者合并，共计27例。901T＞C位点不同基因型患者的PD-L1基因mRNA表达见图3。相对于TT基因型患者，TC/CC型患者癌组织中PD-L1基因mRNA表达水平明显较高（4.08±1.11vs2.63±1.78），差异有统计学意义（P＜0.001）。

图3 PD-L1基因901T＞C位点不同基因型PD-L1基因mRNA表达情况对比Figure 3 Relative expression of PD-L1 mRNA in the colorectal cancer patients with different 901T＞C genotypes

3 讨 论

本研究纳入的265例CRC患者接受卡培他滨为基础辅助化疗的中位DFS为4.6年（95%CI：3.83～5.35），中位OS为6.5年（95%CI：5.74～7.27），总体数值低于NO16968的研究结果［13］。推测原因在于本研究纳入了较多的ECOG评分为2分的患者，NO16968研究中只纳入了ECOG评分为0～1分的患者，且均接受了卡培他滨联合奥沙利铂的化疗方案。

CRC在临床治疗结果和预后上也有较大的个体差异［14］。目前已经有较多可以预测CRC疗效的生物标记物。2018年报道的VEGFR2基因多态性对接受卡培他滨为基础辅助化疗的治疗结果的影响［15］；2017年报道的四氢叶酸转移酶MTHFR多态性对氟尿嘧啶疗效的影响［16］；2016年报道的胸苷酸合成酶TS多态性对结肠癌一线5-FU放疗疗效的影响［17］。这些研究结果均提示药物基因组学在CRC疗效预测方面的价值。

本研究报道了在中国CRC患者接受5-FU为基础的辅助化疗方案时，PD-L1基因901T＞C位点的C等位基因携带者可能通过影响该基因的表达，从而影响接受5-FU为基础辅助化疗的CRC患者预后。首先，本研究中901T＞C位点的最小等位基因频率为0.17，这与NCBI数据库中国人群中的突变频率一致；另外也与Xie等［12］的研究中901T＞C位点的分布频率基本一致。Xie等［12］研究纳入225例肝癌患者和200例健康志愿者，通过对PD-L1基因上4个多态性位点进行基因分型。结果发现901T＞C位点CC基因型患者和肝癌发生风险显著相关。另外，在该位点和肝癌患者预后分析方面，Xie等［12］研究和本研究结果也基本一致，即901T＞C位点较少等位基因携带患者的预后较差。另外，Du等［18］的研究探讨了位于PD-L1基因的3′-UTR区域的多态性901T＞C位点和非小细胞肺癌的易感性的研究。荧光素酶报告实验的结果表明901T＞C位点通过扰乱miR-296-5p、miR-138以及PD-L1基因mRNA，从而影响了非小细胞肺癌的易感性。Du等［18］研究的901T＞C位点的分布频率和本研究存在差异，可能缘于纳入癌种差异。Xie等［12］研究也初步提示有类似趋势；但Du等［18］的研究并没有继续探讨901T＞C位点不同基因型患者的PD-L1基因mRNA表达情况。

另一方面，PD-L1基因是目前肿瘤免疫治疗领域的热点基因，多项免疫治疗的临床研究结果显示PD-L1的表达水平可以预测PD1和PD-L1抑制剂的疗效［19］。然而，在PD-L1基因表达水平和接受常规化疗的CRC患者预后的关联上，目前尚存在较大的争议。本研究结果初步表明PD-L1基因mRNA高表达的人群在接受5-FU辅助化疗时具有较差的预后，这和先前Enkhbat等［20］的研究结果一致。他们的研究纳入了116例手术切除的Ⅱ期和Ⅲ期的CRC患者，分析了PD-1、PD-L1，以及TGF-β的表达水平相关性和预后的关系，发现PD-L1高表达的人群预后较差。然而，另一方面也有很多研究结果发现，PD-L1基因编码的蛋白主要表达在肿瘤细胞表面，通过与激活的T细胞表面PD-1结合，进而抑制T细胞活性，引起T细胞凋亡；但体内的作用尚存疑问。因此，也有部分临床研究结果表明，PD-L1高表达人群患者的预后较好［21］。这些结果可能和纳入研究样本的异质性、接受辅助化疗等情况相关，故尚需要进一步的深入探讨。

总之，本研究发现了在中国CRC人群当中PD-L1基因901T＞C位点是一个独立的预后影响因素。本研究也存在一定局限性：首先纳入研究的样本量较少，缺乏大样本中评估该位点的预后指导意义；另外，研究为回顾性分析，存在研究偏倚。今后的研究可能需要从更大的样本中继续探讨，同时也要从PD-L1基因蛋白表达层面去分析该基因的蛋白表达和临床结果的关联，从而阐明该位点造成预后差异的根本原因。