QF-PCR 技术在产前诊断胎儿染色体非整倍体疾病中的应用

潘锦梅 梁西岚 黎洛冰 刘沃满 陈小乐

荧光定量PCR(quantitative fluorescent polymerase chain reaction)是目前临床应用较多的一种产前染色体异常的筛查和诊断方法, 能快速、准确、自动化的进行唐氏综合征及其他染色体非整倍体检测［1］。本院2016 年3 月～2018 年3 月共对1940 例病例样本行21、18、13、X 及Y 染色体非整倍体的QF-PCR 技术诊断, 并将诊断结果与核型分析结果进行比较。考察QF-PCR 技术诊断常见染色体非整倍体疾病的敏感性和特异性, 评价其在染色体非整倍体疾病快速产前诊断中的应用价值。现具体报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择本院2016年3月~2018年3月1940例产前诊断病例样本作为研究对象。

1.2 方法 采用QF-PCR 技术对样本行21、18、13、X及Y染色体非整倍体诊断。

1.2.1 样本 DNA的提取 所有孕妇在17 周后行羊水穿刺,采用美国伯乐公司的生产的BIO- RAD Chelex-100 Resin 抽提试剂盒获取样本DNA。

1.2.2 引物合成 从NCBI 数据库中查取引物序列, 利用Primer 3.0 设计PCR 引物序列, 对检测位点正向引物的“5”端进行FAM(蓝色)或HEX(绿色)荧光标记。各染色体的STR 位点见表1。

1.2.3 PCR扩增 反应体系包括Takara 2×PCR 反应预混液 12.5 μl, 引物混合液7.5 μl, 模板 DNA 50～100 ng。反应条件为DNA 样本95℃预变性5 min, 94℃ 变性30 s, 60℃保温30 s, 72℃延伸1 min, 30 个循环, 72℃延伸7 min, 4℃条件下保存。

1.2.4 凝胶电泳 取1 μl 的PCR 产物, 与9 μl 上样液(包括8.7 μl 甲酰胺+0.3 μl 分子内标)混合, 95℃变性5 min 后0℃冷却5 min, 进行凝胶电泳30 min。

1.3 判定标准

1.3.1 QF-PCR的检测结果 采用GeneScan3.7软件进行分析处理, STR位点上等位基因扩增后显示为3个峰值面积比接近于1∶1∶1的荧光峰, 可直接判断为三体型；若显示为2个峰, 且双峰面积比值>1.8或者<0.65可判定为三体；双峰面积比值区间0.8~1.4则需重新检测［2,3］。

1.3.2 染色体核型分析 按照常规细胞培养和G显带制片,参照人类细胞遗传学国际命名体制(ISCN 2009)标准进行核型分析。各染色体的STR位点见表1。

表1 各染色体的STR位点

2 结果

1940 例羊水QF-PCR 检测结果均在3 d 内得出, 共有5 例染色体核型培养失败, 检出97 例(5.00%)异常病例, 包括21 三体综合征62 例、18 三体综合征16 例、13 三体综合征4 例、性染色体异常17 例, 其中18 三体同时性染色体数目异常1 例、衍生Y 性染色体异常1 例、易位型13 三体1 例、18 三体嵌合体1 例。漏检23 例, 10 例为嵌合体,13 例为结构异常, 其中10 例嵌合体包括7 例染色体数目异常嵌合和3 例染色体结构异常嵌合。见表2。

表2 1935例羊水QF-PCR检测结果及染色体核型分析结果(n)

3 讨论

染色体异常胎儿常合并智力低下、多发畸形、发育障碍、中枢神经系统异常以及成年后的各种疾病的发生, 是影响出生人口素质的重要原因。21 三体、18 三体、13 三体、性染色体异常是新生儿出生缺陷最常见的染色体异常的类型, 产前对胎儿进行染色体非整倍体疾病筛查是降低出生缺陷率的重要方法［4］。

QF-PCR 是目前临床应用较广的一种产前染色体异常的检测方法, 主要是通过对STRs 扩增, 快速诊断染色体数目拷贝异常的一种方法。QF-PCR 能提供高度完整的遗传信息,具有高敏感性、高特异性和高效性等优点。本研究中对1940例羊水样本行QF-PCR 检测, 21、18、13 和性染色体分别选用5、5、4、8 个STRs 位点。所有结果均在72 h 内得出。共检出97 例(5.00%)异常病例, 多由高龄孕妇的卵子在减数分裂时染色体不分离所致。此外, 研究共漏检23 例, 多为嵌合性异常类型。这是因为上述结构异常并不在QF-PCR 检测范围内, 其解决方法包括是对非超声异常病例进一步的进行核型分析, 以避免漏掉一部分结构异常和一些低水平嵌合体。但与此同时, 该结果的出现也表明QF-PCR 技术的检测存在一定局限性, 即诊断对信息量要求较高, 当STR 位点特异性不高时, 容易出现漏诊现象［5］。其次, 研究［6-9］也指出目前应用的QF-PCR 技术不能准确检测出染色体平衡易位或异常核型＜15%的三体细胞和＜20%单体细胞存在时嵌合体。

综上所述, QF-PCR 检测染色体非整倍体疾病具有较好的敏感性和特异性, 是一种简便、可靠的产前诊断染色体非整倍体分子诊断技术。但是, QF-PCR 也存在一定的局限性,其诊断技术需要不断完善和研究, 发掘出更多有价值的遗传标记。但在目前的产前临床诊断中, QF-PCR 更适合作为一种辅助诊断方法。