微波-超声辅助联合提取银杏叶中总黄酮的工艺研究

冯靖，彭效明，*，李翠清，*，王腾，居瑞军，邱晓，陈亮

（1.北京石油化工学院，燃料清洁化及高效催化减排技术北京市重点实验室，化学化工国家级示范中心，北京102617；2.北京电子科技职业学院生物工程学院，北京100176）

银杏树是东亚国家的经济树种，又名白果树。我国是银杏树的故乡，占有全世界银杏树总量的70%以上，银杏树的叶、根、果均可作药用，其中银杏叶的药用价值最为突出，这主要是由于银杏叶中含有丰富的黄酮类化合物，黄酮类化合物是具有色酮环为基础的一类化合物，其药理作用有抗氧化、抗菌、抗肿瘤以及对心脑血管的保护作用等，近年来得到广泛的应用和认可。银杏叶在我国已经有60 多年的药用历史，可见其药用价值之可观，同时也是近10年来学术界研究的重点和焦点。因此缩短试验时间，提高黄酮类化合物的提取量有着非常重要的意义[1-5]。

本文利用超声-微波辅助联合提取法与醇提法来提取银杏叶中黄酮类化合物，并利用响应面的方法优化试验条件，探究最佳试验条件，此提取方法相比较传统的提取方法，大大缩短了试验时间的同时提高了黄酮类化合物的提取量，具有非常重要、深远的意义，为银杏叶黄酮类化合物的更广泛应用提供了强而有力的支持[6-10]。

1 材料与方法

1.1 材料

试验所用仪器见表1。

表1 试验仪器Table 1 Experimental equipment

试验所用试剂见表2。

表2 试验试剂Table 2 Experimental reagent

1.2 方法

1.2.1 标准曲线的建立

芦丁标准曲线溶液的配制：称取芦丁标准品5.0 mg，以去离子水定容至50 mL，配制成浓度为0.1 mg/mL 的芦丁标准溶液。分别取芦丁标准溶液0.00、0.10、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.4、1.6 mL 到10 mL 棕色容量瓶中，加入70%乙醇，使得溶液体积为2 mL，再加入5%NaNO20.3 mL，摇匀静置6 min，加入10 %Al（NO3）30.3 mL，摇匀静置6 min，加入10%NaOH 3.0 mL，摇匀静置15 min。配制芦丁含量为：0、0.001 8、0.003 6、0.007 1、0.010 7、0.014 3、0.017 9、0.025、0.022 6 mg/mL的芦丁标准品溶液[11]。紫外吸光度的测量：开机预热紫外分光光度仪0.5 h，分别在510 nm 处测量吸光度，记录吸光度值，绘制标准曲线。

1.2.2 黄酮类化合物检测方法的方法学验证

1.2.2.1 准确度

取芦丁含量为：0.035 7 mg/mL 的供试品溶液，加入芦丁含量为0.071 4 mg/mL 的对照品溶液混合，每个浓度制备3 份供试品溶液进行测定，对9 个测定结果进行评价[12-16]。回收率计算见公式（1）：

式中：C 为实测值；A 为供试品所含被测成分量；B为加入对照品量，利用公式（2）计算得到的回收率相对标准偏差：

1.2.2.2 精密度

利用重复性来表示试验精密度，取芦丁含量为0.003 6 mg/mL 的供试品溶液，测定6 次，对测定结果进行评价。

1.2.2.3 线性

本试验的线性即为芦丁标准品的标准曲线。

1.2.2.4 定量限

将浓度为0.001 8 mg/mL 的溶液测量吸光度后带入标准曲线，计算定量限。

1.2.2.5 范围

将检测范围定为线性范围的±20%，带入标准曲线，计算检测范围。

1.2.2.6 耐用性

利用溶液的稳定性来衡量试验方法的耐用性，取0.023 mg/mL 的待测溶液避光静置0、1、2、3、4、5、7、10、13、24 h 后分别用分光光度计测定含量。

1.2.3 银杏叶总黄酮的提取与检测、计算方法

1.2.3.1 银杏叶中总黄酮的提取方法

将银杏叶打磨成粉，过60 目筛，密封后，放入避光处保存。取10 g 已过筛的银杏叶粉称量，加入到200 mL 70%的乙醇溶液中，使得液料比为20∶1（mL/g），将溶液放入微波催化合成萃取仪中，设置微波提取参数为：微波功率100 W，微波时间2.0 min。完成微波辅助提取后，将溶液搅拌均匀，倒入250 mL 烧杯中，放入超声波细胞粉碎仪中，进行超声波提取，设置超声波辅助提取参数：超声间隙和超声时间2 s/2 s，超声功率为228 W，超声时间4 min。超声波辅助提取完成后，将溶液放入低速离心机，设置离心机参数：离心转速1 500 r/min，离心时间5 min，待离心完成后，取上清液备用，取沉淀物进行二次提取，将二次提取离心后上清液与第一次提取上清液混合，即为提取液，记录提取液体积[17-20]。

1.2.3.2 总黄酮含量检测及计算方法

取提取液1 mL 于10 mL 容量瓶中，以70%乙醇定容到10 mL，取1 mL 稀释液，按照标准曲线黄酮类化合物的检测方法进行检测，将测得的紫外吸光度值带入标准曲线中，计算银杏叶中总黄酮类化合物的含量，计算公式如公式3。

式中：A表示紫外分光光度仪检测数据；B表示稀释倍数；V表示提取液总体积，mL；m表示银杏叶粉的质量，g。

1.2.4 单因素试验

1.2.4.1 超声时间对黄酮类化合物提取量的影响

按照试验参数：微波功率100 W，微波时间2.0 min，液料比20∶1（mL/g），超声功率228 W，探究超声时间分别为0、2、4、6、8 min 时对黄酮类化合物提取量的影响。

1.2.4.2 超声功率对黄酮类化合物提取量的影响

按照试验参数：液料比20∶1（mL/g），微波功率100 W，微波时间2.0 min，超声时间4 min，改变超声功率，探究超声功率分别为204、216、228、240、252 W 时对黄酮类化合物提取量的影响。

1.2.4.3 微波时间对黄酮类化合物提取量的影响

按照试验参数：液料比20∶1（mL/g），微波功率100 W，超声时间4 min，超声功率228 W，探究微波时间分别为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 min 对黄酮类化合物提取量的影响。

1.2.4.4 液料比对黄酮类化合物提取量的影响

按照试验参数：微波功率100 W，微波时间2.0 min，超声时间4 min，超声功率228 W，改变液料比，探究液料比分别为10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1（mL/g）时液料比对黄酮类化合物提取量的影响。

1.2.5 响应面试验

以超声功率（A），超声时间（B），液料比（C），微波时间（D）为影响因素，黄酮类化合物为响应值，利用design expert 8.0 对所得数据进行分析拟合，对影响因素进行响应面优化试验，试验因素水平编码见表3。

表3 试验因素水平编码Table 3 Experimental factors level and the coding

1.2.6 提取物鉴定

对提取液进行旋蒸浓缩，冷冻干燥后得到提取物粉末。对粉末进行红外扫描。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的建立

标准曲线如图1。

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Rutin standard curve

即：y=12.256 7x+0.003 96，R2=0.999 04，符合2015年版中华人民共和国药典一部要求。

2.2 黄酮类化合物检测方法的方法学验证

2.2.1 准确度

试验所得回收率的相对标准偏差为1.19%，符合2015年版中华人民共和国药典一部要求。

2.2.2 精密度

取浓度为0.003 6 mg/mL 的溶液紫外吸光度，吸光度测定6 次均为：0.044，试验显示，重复性良好，符合2015年版中华人民共和国药典一部要求。

2.2.3 线性

试验线性即为标准曲线，试验显示，y=12.256 7x+0.003 96，R2=0.999 04，线性良好，详见2.1。

2.2.4 定量限

所以将检测限定为0.001 8 mg/mL，R2达到0.999 04，符合2015年版中华人民共和国药典一部要求。

2.2.5 范围

芦丁检测范围试验结果见图2。

图2 芦丁检测范围Fig.2 Rutin detection range

由图2可知，将检测范围定为：0～0.03 mg/mL，R2达到0.999 41，符合2015年版中华人民共和国药典一部要求。

2.2.6 耐用性

黄酮类化合物溶液稳定性结果见图3。

图3 黄酮类化合物溶液稳定性Fig.3 Stability of flavonoid solution

由图3可知，黄酮类化合物随着时间的延长，含量会逐渐下降，所以黄酮类化合物的含量应尽快检测，黄酮类化合物溶液也需要现配现用。

2.3 单因素试验

2.3.1 超声时间对黄酮类化合物提取量的影响

超声时间对黄酮类化合物提取量的影响结果见图4。

图4 超声时间对黄酮类化合物提取量的影响Fig.4 Effect of ultrasonic time on the extraction of flavonoids

由图4可知，超声时间在4 min 时，黄酮类化合物的提取量最高，达到24.309 5 mg/g，超声时间过短，会造成黄酮类化合物提取不完全，超声时间过长，提取量下降迅速，超声时间过长过强，会使得过强空化作用破坏了黄酮类化合物的结构，从而使得黄酮类化合物的提取量降低。

2.3.2 超声功率对黄酮类化合物提取量的影响

超声功率对黄酮类化合物提取量的影响结果如图5。

图5 超声功率对黄酮类化合物提取量的影响Fig.5 Effect of ultrasonic power on the extraction of flavonoids

由图5可知，超声功率在228 W 时提取量最高，达到24.309 5 mg/g，超声功率过小，使得黄酮类化合物提取不完全，同样的，超声功率过强，提取量下降迅速，过强的空化作用会破坏黄酮类化合物的结构，从而使得黄酮类化合物的提取量降低。

2.3.3 微波时间对黄酮类化合物提取量的影响

微波时间对黄酮类化合物提取量的影响结果见图6。

图6 微波时间对黄酮类化合物提取量的影响Fig.6 Effect of microwave time on the extraction of flavonoids

由图6可知，微波时间为2.0 min 时，黄酮类化合物的提取量最高，达到24.309 5 mg/g，微波时间多短，使得黄酮类化合物不能完全从银杏叶中提取出来，微波时间过长，提取温度上升过高过快，会破坏了黄酮类化合物的结构，从而降低了黄酮类化合物的提取量。

2.3.4 液料比对黄酮类化合物提取量的影响

液料比对黄酮类化合物提取量的影响结果见图7。

图7 液料比对黄酮类化合物提取量的影响Fig.7 Effect of liquid-material ratio on the extraction of flavonoids

由图7可知，液料比为20∶1（mL/g）时，黄酮类化合物提取量最高，达到24.309 5 mg/g，当液料比过小时，黄酮类化合物提取不完全，液料比过大时，过高的乙醇浓度会破坏黄酮类化合物的结构，从而降低了黄酮类化合物的提取量。

2.4 响应面试验

利用design expert 8.0 对所得数据进行分析拟合，得到黄酮类化合物对A，B，C，D的二次多项回归方程为：Y=24.31-0.088×A+0.13×B+0.10×C+0.17×D-0.76A×B+0.013×A×D+0.064×B×C+0.35×B×D-0.28×C×D-0.90A2-1.35×B2-1.86×C2-0.33×D2

对黄酮类化合物进行四因素三水平的响应面试验，共29 组响应面试验及结果见表4。

响应面所得到的回归方程显著性参数见表5。

表4 黄酮类化合物响应面设计数据Table 4 Response surface design data of flaronoids

表5 回归方程显著性及方差分析Table 5 Regression coefficients and ANOVA results

续表5 回归方程显著性及方差分析Continue table 5 Regression coefficients and ANOVA results

由表5可以看出此模型的P值为0.008 2，远远小于0.01，回归方程相关系数为0.936 5，证明此模型的显著性为显著，拟合模型较好，该试验的设计合理，所得到的回归方程可以较好地反映各个因素对于黄酮类化合物提取量的影响，利用该模型得到的最佳工艺条件是合理的。各个因素对黄酮类化合物的影响排序为：微波时间＞超声时间＞液料比＞超声功率，交互项对黄酮类化合物影响排序为超声功率与超声时间＞超声时间与微波时间＞液料比与微波时间＞超声功率与微波时间大于超声时间与液料比，二次项对黄酮类化合物影响排序为：液料比＞超声时间＞超声功率＞微波时间。

试验中各个因素交互作用响应立体面及对应等高线图8。

由响应面所得到的等高线图和3D 图见图8，等高线所得的趋势线越似椭圆，两个因素的交互作用就越明显，所以由图8可知，超声功率与超声时间的交互作用最明显，而超声时间与液料比之间的交互作用最弱。同时，由各个因素所得到的3D 图可知，响应面最高点对应的各个因素值即为最佳试验条件，最高点所对应的纵坐标即为黄酮类化合物的最高提取量[21-23]。

图8 黄酮类化合物响应立体图与等高线图Fig.8 Contour map and 3D plot of flavonoid response surface

根据响应面分析得到的黄酮类化合物最佳试验条件为：超声功率：227.4 W，超声时间：2.16 min，液料比：19.75∶1（mL/g），微波时间：1.985 min。为方便试验操作，最佳条件设定为：超声功率：228 W，超声时间：2 min，液料比20∶1（mL/g），微波时间2 min。为检验上述所得最佳试验条件的可靠性，利用上述最佳工艺条件提取黄酮类化合物，得到黄酮类化合物的提取量为24.309 5 mg/g，理论上可得到黄酮类化合物的提取量为24.322 5 mg/g，相对误差为0.05%。

2.5 提取物的鉴定

提取物红外扫描图谱见图9。

图9 提取物的红外光谱图Fig.9 Infrared spectrum of the extract

根据图9，芳香环的C-H 伸缩振动峰为3 364、1 657 cm-1为羰基吸收峰，羰基峰本身是出现在1 740 cm-1～1 700 cm-1的峰，此谱图羰基峰出现红移是由于羰基与芳香基出现共轭而引起的。1 607 cm-1为苯环骨架的伸缩振动峰，1 273 cm-1为芳香醚的特征吸收峰。

黄酮类化合物的基本结构见图10。

由图10 可知，提取物红外扫描结果与与图10中黄酮类化合物基本结构一致，所以提取产物确定为黄酮类化合物。

图10 黄酮类化合物基本结构Fig.10 Basic structure of flavonoids

3 结论与展望

该文采用的微波-超声联合提取黄酮类化合物的方法不仅可以明显缩短试验时间，并且在很大程度上提高了银杏叶中黄酮类化合物的提取量，同时，本文采用Design-Expert 软件来设计各个影响因素的响应面试验，建立数学模型，优化了试验条件，当在响应面优化的最佳试验条件：超声时间4 min，超声功率228 W，微波时间2 min，液料比20∶1（mL/g），银杏叶中总黄酮的最高提取量达到24.309 5 mg/g。表明此项研究有着重要的意义，为银杏叶中黄酮类化合物的应用提供了更广阔的前景。