两步磁珠法提取血浆游离DNA的评价及临床应用

王 晖,李 瑶,钟雪锋,马雅立,李传保*

(1北京医院肿瘤科,国家老年医学中心,北京 100730;2北京医院检验科,国家老年医学中心;3北京医院呼吸与危重症医学科,国家老年医学中心;*通讯作者,E-mail:lichuanbao3662@bjhmoh.cn)

游离DNA(cell free DNA,cf-DNA)是一种胞外DNA,主要是由单链或双链DNA以及单链与双链DNA的混合物组成。健康人和肿瘤患者外周血中都存在cf-DNA[1],但肿瘤患者外周血cf-DNA的含量与健康人相比有显著性的升高[2],且肿瘤患者外周血cf-DNA存在基因突变、重组、缺失等[1],临床研究表明,cf-DNA能有效反映患者整体的肿瘤负荷、恶性程度、转移能力以及实时的基因突变信息,与肿瘤组织的基因信息呈一定相关性[3]。通过对血浆cf-DNA测序检测肿瘤相关的基因拷贝数变化[4]、甲基化变化[5]、核苷酸突变变化[6]、染色体重排变化[7]等已广泛应用于临床诊断、用药指导和检测肿瘤发生情况[8],由于无法对血浆中小片段DNA进行精准提取,利用cf-DNA定量进行肿瘤等疾病的辅助实验室诊断的报道很少。本研究通过两步磁珠法提取肺癌患者血浆游离DNA中的小片段cf-DNA,以期获得最佳的cf-DNA提取方法,为肿瘤等疾病的辅助实验室诊断提供依据。

1 研究对象和方法

1.1 研究对象

收集2015-07～2015-09北京医院的肺癌患者血浆样本共15例,肺癌的诊断依据NCCN肺癌诊断指南[9];健康人血浆样本15例。所有样本均在患者签署了书面知情同意书后收集。

1.2 主要试剂和仪器

cf-DNA采血管、磁珠法游离DNA试剂盒(美国Life公司),分离柱提取法提取游离DNA试剂盒(德国Qiagen公司),琼脂糖凝胶成像系统(美国BIO-RAD公司),Quick-load@100 bp DNA ladder(美国Promega公司),Qubit浓度检测试剂盒(美国Life公司),Agilent 2100生物芯片分析仪(美国Agilent公司)。

1.3 血液采集、处理、储存

用cf-DNA采血管,分别采集15例肺癌患者和15例健康人抗凝血4-5 ml。4 h内4 ℃以2 000 r/min离心10 min,取上清至2 ml离心管中,健康人血浆用50 ml离心管收集混匀,-20 ℃保存待用。

1.4 两步磁珠法提取血浆cf-DNA

第一步分离:取2 ml离心管,加入500 μl样本,再分别加入100 μl的Proteinase K(1 000 μl)的Lysis Buffer和50 μl的磁珠,涡旋振荡混合均匀,将离心管置于55 ℃孵育20 min(每10 min涡旋振荡10 s),将离心管置于磁力架上6 min,至溶液澄清,吸取上清至另一15 ml离心管中,编号2。800 μl 80%的乙醇洗涤磁珠2次,晾干磁珠,加入50-100 μl水重悬磁珠,55 ℃孵育10 min,将离心管置于磁力架上2 min,吸取上清至一个新的离心管中即为第一步分离的DNA。

第二步分离:于编号2离心管中加入100 μl磁珠和1 150 μl的Binding Buffer,涡旋振荡混合均匀,将离心管在室温静置20 min(每隔10 min涡旋振荡10 s),将离心管置于磁力架上6 min至溶液澄清,弃上清。1 600 μl Washing BufferⅠ洗涤2次，1 600 μl Washing Buffer……洗涤1次，800 μl Washing Buffer……洗涤1次，晾干磁珠，加入50-100 μl Elution Buffer重悬磁珠，55 ℃孵育10 min，将离心管置于磁力架上2 min，吸取上清至另一新的离心管中，即为第二步分离的DNA。

1.5 分离柱提取法提取血浆cf-DNA

分离柱提取法提取血浆cf-DNA选取Qiagen游离DNA提取试剂盒提取,操作步骤见试剂盒说明书。

1.6 cf-DNA定量、片段大小分布检测

用Qubit DNA浓度检测试剂盒检测不同方法提取的DNA浓度,2%的琼脂糖凝胶分离DNA,凝胶成像分析片段大小分布。采用Agilent 2100生物芯片分析仪对DNA片段大小分布进行检测。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 两步磁珠法DNA回收量与掺入标准品DNA片段浓度呈正相关

为评估磁珠法对血浆小片段cf-DNA的提取效率,选取127 bp和208 bp标准品DNA片段等摩尔浓度梯度掺入健康人血浆,浓度梯度为0，7.5，15，30，60，120 ng/ml,采用两步磁珠法提取血浆中DNA标准品。结果表明,第一步提取的DNA浓度与掺入标准品DNA片段浓度不相关(P=0.711 6),DNA浓度相对恒定;第二步提取的DNA浓度与掺入标准品DNA浓度呈正相关(r2=0.971 6,P<0.001,见图1)。结果提示,两步磁珠法可有效提取血浆中小片段DNA。

图1 两步磁珠法提取DNA浓度及其相关性分析Figure 1 Concentration of DNA extracted by two-step magnetic bead method and its correlation analysis

2.2 两步磁珠法可有效分离不同大小DNA片段

将100 bp DNA ladder加入到健康人血浆中,用两步磁珠法和分离柱法分别提取掺入的标准品DNA。100 bp DNA ladder包含11个片段,大小范围为100-1 000 bp,间距为100 bp,外加一条1 500 bp条带。结果显示,分离柱法仅可提取≤1 500 bp的cf-DNA片段,而两步磁珠法可有效分离不同大小片段,第一步分离的DNA片段≥300 bp,第二步分离的DNA片段≤300 bp(见图2)。琼脂糖凝胶电泳结果与2100结果一致(见图3)。

2.3 两步磁珠法第二步分离的小片段cf-DNA浓度与肿瘤分期呈正相关

利用两步磁珠法和分离柱提取法分别提取15例明确诊断为肺癌的患者的血浆cf-DNA,根据肺癌分期进行分组,分析各组间cf-DNA浓度差异。结果显示,两步磁珠法提取的血浆cf-DNA浓度与肺癌的分期相关(r2=0.866 4,P=0.004 9),而分离柱提取法提取的血浆cf-DNA浓度与肿瘤分期无显著相关(见表1、图4)。

表1 不同分期肺癌者血浆cf-DNA浓度 (ng/ml)

3 讨论

正常人和肿瘤患者cf-DNA浓度范围跨度很大,每毫升血液中约有0-5 400 ng cf-DNA。研究显示,肿瘤患者cf-DNA浓度普遍高于正常人群[9]。cf-DNA是血浆中游离存在的DNA,它们有的来自于正常细胞,有的来自于异常细胞(如肿瘤细胞),其总量处于动态变化中。比如患者体内肿瘤质量达100 g,大约有3×1010个肿瘤细胞,每天约3.3%的肿瘤DNA进入血循环。进入血循环的cf-DNA片段大至21 kb,小至70-200 bp[10]。肝癌患者外周血肿瘤来源cf-DNA(circulating tumor DNA,ct-DNA)小于166 bp[5],在结直肠癌中80%的ct-DNA小于145 bp[11]。研究证明,cf-DNA水平和肺癌临床复发、转移及预后生存相关,提示cf-DNA可成为临床监测肿瘤的有效指标[11]。目前,越来越多的研究支持cf-DNA测序在肿瘤疗效评估方面具有重要意义,利用cf-DNA定量进行肿瘤等疾病的辅助实验室诊断的报道很少。

由于cf-DNA的异质性,利用cf-DNA定量进行辅助诊断的前提是对肿瘤来源的小片段cf-DNA的精准提取。传统的cf-DNA提取方法有对酚氯仿异戊醇方法、分离柱提取法和磁珠提取法,Qiagen游离DNA分离柱提取试剂盒常被用于相关方法学研究的金标准[12],但无法分离不同大小片段游离DNA。本研究在磁珠提取法的基础上,通过两步洗脱对正常血浆中DNA标准品和肺癌患者血浆中cf-DNA进行提取,与Qiagen游离DNA分离柱法相比,本方法可分离不同大小片段的cf-DNA,同时有效提高血浆中小片段cf-DNA的比率。磁珠第一步分离可提取大片段的cf-DNA(≥300 bp),第二步分离可有效提取小片段的cf-DNA(≤300 bp)

利用两种方法分别对15例确认肺癌患者的血浆cf-DNA进行提取,结果显示两步磁珠法第二步分离可提取小片段cf-DNA,同时其浓度与肺癌的分期呈正相关,而分离柱提取法提取的DNA浓度与肿瘤分期无相关性。

上述结果提示,与分离柱提取法相比,两步磁珠法可有效提取的肿瘤来源的cf-DNA,增加肿瘤基因检测的准确性,降低检测结果的假阴性。研究发现两步磁珠法cf-DNA定量结果与肺癌的分期有一定相关性,提示利用cf-DNA定量辅助肺癌诊断有一定的可行性,由于入组病例较少,尚需较大量样本研究的数据支持。