艾拉莫德对人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226增殖和凋亡的影响

高秋英,侯丽敏,张 玎,荀利如

(1陕西省人民医院血液科,西安 710061;2陕西省人民医院肾病血透中心;*通讯作者,E-mail:Wj-Xia78@126.com)

多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是起源于B细胞系并能够产生单克隆免疫球蛋白的恶性增殖性疾病,同时伴有广泛的溶骨性病变和骨质疏松;治疗MM的方法有多种如造血干细胞移植。然而,目前MM仍不能完全治愈,易产生耐药反应,并且患者最后多死于本病的复发,如疼痛、感染、衰竭、肾功不全[1,2]。因此,寻找新的治疗药物迫在眉睫。

艾拉莫德是我国自行研发的一类新抗风湿性药物,具有独特的抗炎作用,可有效缓解炎性疼痛、保护骨质及促进骨质沉积。现已经作为治疗类风湿关节炎一线推荐药物。其能抑制免疫球蛋白及细胞因子生成,抑制骨吸收,促进骨形成[3,4],均与多发性骨髓瘤的治疗机制不谋而合,提示艾拉莫德有望成为多发性骨髓瘤的潜在治疗药物。为了明确艾拉莫德对多发性骨髓瘤发生发展的影响。本研究拟探讨艾拉莫德对MM细胞增殖和凋亡的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株及主要试剂

人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226细胞来源于中科院上海细胞库,艾拉莫德片(25 mg,H20110084)由先声药业合成研究所提供,RPMI-1640培养基购买于美国Gibco公司,胎牛血清来源于美国Hyclone公司,Hoechst 33258染色试剂购自碧云天生物技术公司。Notch1抗体均购自于美国Cell Signaling Technology,GAPDH抗体以及二抗均购买于Proteintech公司。逆转录试剂盒以及SYBR PremixEx Taq试剂盒均购买于TaKaRa公司。

1.2 细胞培养及实验分组

将RPMI8226细胞复苏后,加入含有10%血清的1640完全培养基,并放于条件为37 ℃、5% CO2的恒温培养箱中培养。待细胞融合度达到90%左右时,进行传代处理。艾拉莫德处理细胞24 h,检测细胞活力,mRNA以及蛋白表达水平。实验分组为:对照组(0 μg/ml iguratimod),10 μg/ml艾拉莫德处理组,20 μg/ml艾拉莫德处理组,30 μg/ml艾拉莫德处理组。

1.3 MTT法检测定细胞增殖

取处于对数生长期的RPMI8226细胞,0.25%胰酶消化并离心,以每孔5×103个的细胞密度均匀接种于96孔板,于条件为37 ℃、5% CO2培养。待细胞发生贴壁后,用浓度为0,10,20,30 μg/ml的艾拉莫德作用细胞24 h。每组设6个复孔。于艾拉莫德作用终止前4 h,将20 μl浓度为5 mg/ml的MTT试剂加入到每个孔中并继续培养4 h,然后弃去MTT溶液,再加入150 μl的DMSO并放置于37 ℃培养箱中继续孵育30 min，晶体溶解后,在波长大小为490 nm的条件下,使用酶标仪测定每孔的吸光度。

1.4 Hoechst 33258染色检测凋亡细胞形态

取处于对数生长期的RPMI8226细胞,并将其均匀接种到24孔板,待细胞发生贴壁后,给予不同浓度的艾拉莫德作用细胞24 h。弃去培养液,于摇床上用预冷PBS洗涤细胞3次,每次1 min。每孔加入预冷的4%的甲醛(500 μl)固定细胞10 min,用预冷PBS洗涤细胞3次,每次1 min。每孔加入500 μl Hoechst 33258染色液,4 ℃避光孵育10 min。再次用预冷PBS洗涤细胞3次,使用荧光显微镜对细胞形态进行观察。正常细胞核呈现出弥漫且均匀的低强度荧光,凋亡细胞的细胞核表现为浓染且致密的固缩形态或者颗粒状荧光。

1.5 荧光定量PCR检测mRNA表达水平

使用Trizol提取细胞总RNA并测算浓度,按照逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录成cDNA,按照SYBR PremixEx Taq试剂盒相关说明书将模板cDNA进行PCR反应,并运用LightCycler 480仪器检测目的基因Notch1的表达。内参基因是GAPDH基因,采用2-ΔΔCt法分析结果。Notch1的正向引物为5′-CACCCATGACCACTACCCAGTT-3′,反向引物为5′-CCTCGGACCAATCAGAGATGTT-3′。GAPDH的正向引物为5′-GACCTGACCTGCCGTCTA-3′,反向引物为5′-AGGAGTGGGTGTCGCTGT-3′。

1.6 Western blot法检测蛋白表达水平

艾拉莫德(0,10,20,30 μg/ml)处理细胞24 h,依照试剂说明书提取细胞蛋白。用BCA蛋白定量试剂盒测定各组样品的蛋白浓度,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),湿法转膜,转膜条件为恒流250 mA,转膜时间为120 min。5%脱脂牛奶封闭PVDF膜。于4 ℃条件下，分别用一抗稀释液(anti-Notch1、anti-Bax、anti-GAPDH)过夜孵育PVDF膜,一抗稀释比例为1 ∶1 000。用TBST洗膜3次,每次10 min。室温用二抗孵育PVDF膜,孵育时间为60 min。TBST洗膜3次,每次10 min。用成像仪显影,使用ImageJ软件进行灰度值分析。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 艾拉莫德抑制人多发性骨髓瘤RPMI822细胞增殖

MTT结果显示,10，20和30 μg/ml的艾拉莫德作用细胞24 h的RPMI822细胞活力分别为74.38% ± 3.35% ,52.16% ± 4.2% ,42.25% ± 4.15% ,显著低于对照组(100% ± 0.00% ),并呈剂量依赖性(见图1),提示艾拉莫德对增殖具有抑制作用。

与对照组比较,*P<0.05,* *P<0.01图1 不同浓度艾拉莫德对RPMI822细胞增殖的影响Figure 1 The effect of different concentrations of iguratimod on RPMI822 cell proliferation

2.2 艾拉莫德促进人多发性骨髓瘤RPMI822细胞凋亡

Hoechst 33258染色结果显示,10，20和30 μg/ml的艾拉莫德处理24 h,RPMI822细胞的细胞核出现固缩、裂解现象,且随着艾拉莫德作用浓度的增加,RPMI822细胞核固缩和裂解情况越严重(见图2),提示艾拉莫德可诱导骨髓瘤RPMI822细胞凋亡。

2.3 艾拉莫德上调骨髓瘤RPMI822细胞促凋亡蛋白Bax的表达

Western blot法检测了艾拉莫德作用下的骨髓瘤RPMI822细胞促凋亡因子Bax蛋白的表达水平。结果显示,与对照组(1.00 ± 0.00)比较,艾拉莫德(10,20,30 μg/ml)处理24 h可剂量依赖性地诱导RPMI822细胞促凋亡蛋白Bax的上调(分别为9.12 ± 0.15,4.06 ± 0.28,8.15 ± 0.19)(P<0.05,见图3)。

图2 Hoechst 33258染色观察艾拉莫德对RPMI822细胞凋亡的影响Figure 2 The effect of iguratimod on the apoptosis of RPMI822 cells

2.4 艾拉莫德抑制骨髓瘤RPMI822细胞Notch1 mRNA和蛋白的表达

本研究检测了艾拉莫德对骨髓瘤RPMI822细胞Notch1 mRNA和蛋白表达的影响。结果显示,10,20,30 μg/ml的艾拉莫德处理RPMI822细胞24 h,Notch1 mRNA表达水平分别为0.51 ± 0.03,0.43 ± 0.02,0.36 ± 0.02;蛋白表达水平分别为0.63 ± 0.06,0.46 ± 0.04,0.32 ± 0.02。艾拉莫德处理后Notch1 mRNA和蛋白表达水平显著低于对照组(P<0.05),提示艾拉莫德对骨髓瘤RPMI822细胞Notch通路的活化具有抑制作用。

与对照组比较,*P<0.05,* *P<0.01,* * *P<0.001图3 不同浓度艾拉莫德对RPMI822细胞Bax蛋白表达的影响Figure 3 The influence of different concentrations of iguratimod on the expression of Bax protein in RPMI822 cells

3 讨论

多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是B细胞恶性肿瘤,其发病率居血液系统恶性肿瘤第2位,虽然大剂量化疗联合自体骨髓移植较传统化疗有更好的疗效,但鲜有患者能达到持续的长期缓解。发病率(2-3)/10万,男女比例1.6 ∶1,常伴有溶骨性损害、高钙血症、肾脏损害等,致畸率高,由于免疫球蛋白等生成受抑,常常合并严重感染并导致临床死亡[5,6]。MM严重威胁了人类的生存健康,传统治疗相关并发症大,副作用高,费用高,给患者带来了沉重的经济及心理压力,寻找新的治疗途径的显得十分重要。

艾拉莫德可有效缓解炎性疼痛、保护骨质及促进骨质沉积[7,8]。艾拉莫德作为新型抗风湿药物,副作用轻,病人耐受性良好,对提高患者生活质量、长期坚持治疗依从性好。其治疗机制涉及抑制免疫球蛋白、细胞因子IL-6的生成,抑制骨吸收,促进骨形成等[9]。艾拉莫德的这些作用均为其治疗多发性骨髓瘤提供了理论基础。RPMI8226是一种常用的人多发性骨髓瘤细胞株,现已被广泛用于MM发病机制研究的体外模型[10-12]。为了探讨艾拉莫德对多发性骨髓瘤的作用,本研究从细胞增殖和凋亡角度观察了艾拉莫德是否影响人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226的生长情况。首先,MTT结果显示,艾拉莫德处理RPMI8226细胞后,其细胞活力明显降低,且具有剂量依赖性,提示艾拉莫德可对RPMI8226细胞增殖产生抑制作用。其次,流式细胞术检测细胞凋亡率的结果显示,艾拉莫德处理的RPMI8226细胞凋亡率显著增加,且随着艾拉莫德作用浓度的增加而增加,表明艾拉莫德可诱导RPMI8226细胞凋亡。本研究发现艾拉莫德对RPMI8226细胞增殖的抑制作用以及对RPMI8226细胞凋亡的促进作用,表明艾拉莫德具有抗MM发生的作用,进一步拓展了艾拉莫德抗肿瘤作用[13]。

在哺乳动物中,Notch家族的基因由高度同源的4种跨膜受体(Notch1-4)以及5个配体(Delta-like1,3,4和Jagged1,2)组成。Notch受体与配体之间的相互作用诱导了两种蛋白水解,即细胞质部分的释放以及活化的Notch发生核转位,进而与转录因子发生相互作用,调控靶基因的转录活性[14]。Notch信号通路具有进化上高度保守的特点,其能够调控细胞分化、凋亡、增殖、形态发生,是多细胞生物胚胎发育的关键信号通路[15]。特别在哺乳动物中,Notch通路能够调节各种过程,如血管生成、肌生成、神经系统发生和造血[14]。大量研究报道,异常活化的Notch信号通路参与了乳腺癌、肺癌以及多发性骨髓瘤等多种肿瘤的发生发展[16-18]。Skrtic等[19]发现,原代MM细胞和体外培养的MM细胞株表达较高的Notch配体、Jagged1以及Notch受体。Notch1通过对人多发性骨髓瘤细胞凋亡产生抑制,增强骨髓瘤细胞的抗药效作用[20]。为进一步探讨Notch信号通路在艾拉莫德抑制MM细胞生长中的作用,本研究检测了艾拉莫德作用下多发性骨髓瘤RPMI8226细胞活化的Notch水平。结果显示,艾拉莫德处理RPMI8226细胞后,活化的Notch水平显著降低,表明艾拉莫德可对Notch的活化产生抑制作用,提示艾拉莫德诱导RPMI8226细胞增殖抑制和凋亡促进的作用与其抑制Notch通路的活化有关。本研究结果再次证实抑制Notch能够抑制肿瘤细胞生长[17,21]。

综上,艾拉莫德可抑制人多发性骨髓瘤细胞的生长,作用机制可能与其抑制Notch的活化有关联,本研究的发现可为艾拉莫德抗肿瘤的作用提供理论依据,同时也可为MM的临床药物治疗提供新的靶点。