自动电位滴定准确检测酱油还原糖含量的研究

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(李锦记(新会)食品有限公司，广东 江门 529156)

酱油在发酵过程中,淀粉质原料被分解产生还原糖,还原糖不仅有助于酱油生色,而且可以被酵母利用生成醇、酸、酯等香气成分[1],特别是还原糖含量与酱油风味物质的生成密切相关。因此,还原糖含量对于酱油的色、香、味都有较大影响,是酱油酿造过程中的一项重要参数。

酱油中还原糖含量的传统测定方法是依据GB 5009.7-2016《食品安全国家标准 食品中还原糖的测定》， 该方法中的直接滴定法，其滴定条件需要人工控制，且反应热源、滴定速度、滴定体积等因素控制对测定结果的影响很大。还需人手在高功率电炉上准确操作，有一定的技术难度和劳动强度，滴定终点靠人的肉眼来判断，误差大[2]。而应用电位滴定技术自动检测还原糖的方法，在葡萄酒和饮料中已有相关研究[3-5]。

原理：在试剂除去蛋白质的干扰后，将一定量的斐林试剂甲、乙液混合后，生成天蓝色的氢氧化铜沉淀，沉淀很快与酒石酸钾钠反应，生成深蓝色的可溶性酒石酸钾钠铜络合物，在加热的条件下，以亚甲基蓝作为指示剂，用0.1%葡萄糖标准溶液进行滴定，还原糖的醛基作为还原部位与酒石酸钾钠铜反应，生成红色的氧化亚铜沉淀，待二价铜全部被还原后，稍过量的还原糖将亚甲基蓝还原为其隐色体，溶液的蓝色消失，即为滴定终点。本文采用自动滴定仪、复合Pt环电极、氧化还原滴定法，应用能斯特方程电位突跃指示法自动识别滴定终点。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

发酵酱油：李锦记(新会)食品有限公司。

硫酸铜、亚甲基蓝、酒石酸钾钠、氢氧化钠、亚铁氰0.1%葡萄糖标准溶液：精确称取在101 ℃ 烘2～3 h至恒重的分析纯无水葡萄糖1.000 g，放入100 mL烧杯中，用蒸馏水定容至1 L，为防染菌，可加5 mL浓盐酸。

1.2 仪器与设备

905自动电位滴定仪、复合Pt环电极 瑞士万通(中国)有限公司；C-MAG HS7 Control加热搅拌器 德国IKA集团；天平 德国赛多利斯公司。

1.3 方法

1.3.1 参数设定调试

选取有RS 232接口的加热搅拌器，接入电脑，采用905自动电位滴定仪、复合Pt金属环电极、智能滴定软件Tiamo，参照国标GB 5009.7-2016《食品中还原糖的测定》方法，设定滴定程序和参数，再进行多次样品测试，对反应过程的各关键影响参数(加热面板温度、搅拌速度、终点电位评估等)逐一进行研究优化。

试样正式滴定：待电炉预热温度至430 ℃左右， 向小烧杯中加入斐林甲液、乙液各5 mL，加入1 mL稀释样品，放在电炉中央，选择方法“正式滴定”，点击“开始”， 在“Sample Size”栏输入预加葡萄糖的mL数(约比预备滴定少1 mL)，点“继续”进行预加体积，待液体沸腾时，点“继续”， 将滴定管和电极小心放进液体里， 软件自动开始计时沸腾30 s，然后开始等量MET滴定，待滴定终点出现后，滴定停止，自动计算结果并写入设备。

1.3.2 精密度测试

选取3个不同的酱油样品，应用以上经调试后的滴定程序参数，进行自动电位法滴定酱油中还原糖的含量。每个样品分别平行测定5次，分析结果。

1.3.3 加标回收率测试

准确称量0.500,1.000,2.000,5.000 g葡萄糖标样，分别加入4份100 mL的酱油b样品中，应用以上方法滴定，测定加标前、加标后样品的还原糖含量。每个样品分别平行测定3次，分析结果。

2 结果与分析

2.1 还原糖含量检测的程序参数

2.1.1 加热温度对结果的影响

反应液的温度与溶解氧的含量有直接的关系。温度越高，溶解氧含量越低。滴定时要保持沸腾状态，使上升的蒸汽阻止空气侵入反应体系中。因此温度的变化对测定结果有很大的影响[6-9]。按以上滴定程序，分别设置不同的加热温度340,380,410,430,450 ℃，测定同一酱油样品的还原糖含量。

图1 还原糖滴定程序Fig.1 Reducing sugar titration procedure

加热温度(℃)还原糖含量(g/dL)结果1结果2结果3平均值3802.6642.5692.6272.6204102.7722.7952.7232.7634302.8522.9262.8942.8914502.8812.8672.9142.887

由表1可知，加热温度较低时，结果较低，即滴定消耗的葡萄糖体积增加。加热温度为430 ℃时和450 ℃结果相近，430 ℃已能提供足够稳定的热源，并保证其后滴定过程保持沸腾状态。避免采用450 ℃或更高的温度对仪器设备带来的不良影响。

2.1.2 搅拌速度对结果的影响

反应液搅拌用的转子大小和搅拌的转速不同，可引起测定误差。转子长度大的转动力度大，转动时反应液会产生较大的漩涡，造成电极浸泡不到反应液而引起的检测误差，易触碰到玻璃电极造成损坏。本研究使用较小的磁力转子(长8 mm)，通过调整不同的转速来测定比较，结果见表2。表明转速小的，检测结果低，即滴定终点滞后，滴定消耗的葡萄糖体积增加。500 r/min已是本仪器的最大设置值，50 mL小烧杯反应液面没有产生较大的漩涡，可满足尽量减少测定误差的要求。

表2 搅拌速度对结果的影响Table 2 Effect of stirring speed on results

2.1.3 滴定速度对结果的影响

国标方法要求严格控制滴定的速度，1滴/2 s，人手控制的准确性差，个体差异大。本研究应用电脑程序精准控制滴定速度，分别设为0.05 mL/s，0.05 mL/2 s，0.05 mL/3 s，结果见表3。

表3 滴定速度对结果的影响Table 3 Effect of titration speed on results

由表3可知，滴定速度越快，滴定消耗的葡萄糖体积越大，结果越小。滴定速度越慢，0.05 mL/3 s，滴定时间越长，反应液的沸腾时间长会引起水分蒸发量大，碱液浓度增高。在一定范围内，溶液碱度越高，二价的铜还原越快，滴定消耗的体积越小，结果越大。为保持检测的稳定性，应严格控制滴定速度和滴定时间。

2.1.4 滴定终点电位评估

还原糖测定的氧化还原反应，应用MET U模式等量滴定，受滴定速度1滴/2 s，反应可逆等因素影响，终点电位突跃不大。若标准设置较大(如>15 mV)，有可能造成仪器无法自动判别出终点；若标准设置较小(如<8 mV)，则可能提前识别出终点，即滴定消耗量偏小，滴定结果偏高。经评估，对等当量识别标准EPC设为10 mV较适合。

经以上测试，得出还原糖含量滴定在优化参数，加热面板温度430 ℃、搅拌速度500 r/min，滴定速度0.05 mL/2 s，终点判断电位评估标准为10 mV。应用Tiamo软件建立的设置见图2。

图2 还原糖滴定参数设置Fig.2 Setting of titration parameters for reducing sugar

2.2 回收率验证

用标准溶液验证，计算检测方法的偏差，判断方法的可行性，进行回收率验证，验证数据见表4。

表4 标准溶液回收率结果Table 4 Recovery test of standard solution

再依据GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》中关于回收率范围的规定[10]，见表5。

表5 回收率范围Table 5 The range of recoveries

得出结论：配制浓度为0.1～10 g/dL的样品检测符合回收率范围规定，此仪器检测0.1～10 g/dL范围的样品结果符合使用。

2.3 酱油样品还原糖检测的精密度测试

表6 酱油还原糖含量检测结果精密度Table 6 Precision of test results of reducing sugar content in soy sauce

由表6可知，应用自动电位滴定法测定3个不同的酱油样品中还原糖的含量，RSD值分别为1.32%，1.13%，1.14%，均<2.00%，结果符合《含量测定分析方法验证的可接受标准》中关于精密度的要求[11]，说明此方法的检测结果准确稳定，精密度高。

图3 自动电位滴定还原糖含量谱图Fig.3 Spectrum of reducing sugar content by automatic potentiometric titration

由图3可知等量滴定模式(MET U)下的滴定过程的曲线，能自动根据电位变化识别出等当点(EP1)，即滴定终点，避免因手工滴定需肉眼判断颜色突变而引起的人为误差，提高检测结果的准确度。

2.4 酱油样品还原糖加标回收率的测试

表7 酱油还原糖加标检测回收率Table 7 Recovery rates of reducing sugar in soy sauce

由表7可知，向酱油b样品中加入定量的葡萄糖标样(0.5～5 g/dL)，测定加标后的回收率，分别为99.00%，98.40%，96.60%，96.92%，都在95%以上，回收率平均值为97.73%。

同时考虑常规发酵酱油产品还原糖含量在0.5%～10%之间，因此仪器符合发酵酱油检测还原糖的要求。

3 结论

应用电位滴定技术，电脑控制加热和搅拌装置，已摸索出较稳定的程序参数。采用此方法检测酱油中还原糖含量，结果精密度高，大大避免了人手滴定造成的误差(尤其添加酱色后的酱油人手滴定终点判断极为困难[12])。为酱油发酵过程的质量监控提供了准确而有效的检测监控。