动物蛋白水解酶法制备南极磷虾多肽及其抗氧化活性

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(1.浙江省海洋水产研究所，浙江 舟山 316021；2.浙江海洋大学 海洋与渔业研究所，浙江 舟山 316021；3.浙江海洋大学 食品与医药学院，浙江 舟山 316022)

南极磷虾(Euphausiasuperba)是存在于南极海域的海洋浮游生物，生物资源量巨大，是地球上最大的潜在动物性蛋白资源库[1]。南极磷虾蛋白是一种优质蛋白，其生物价高于牛乳蛋白和其他动物性蛋白，必需氨基酸含量和评分也高于FAO/WHO推荐的理想蛋白模型，支链氨基酸/芳香族氨基酸比值接近正常人的水平，极具开发应用潜力[2]。蛋白酶水解法是回收食品原料中蛋白质的有效手段之一，通过添加外源酶酶解得到的水解蛋白营养丰富，肠道吸收更好，生物活性更优异，包括抗氧化、降血压、降血糖、抗菌等活性[3]。此外，蛋白水解后可用于制作风味制品，也可作为营养强化剂加入到其他食品中，提高其营养价值，是人们普遍关注的研究热点[4]。实验室前期制备了2种南极磷虾蛋白产品——虾糜和蛋白。因此，本文以它们为原料，通过动物蛋白水解商业复合酶制剂，制备南极磷虾多肽，研究酶解参数，分析多肽分子量组成，并进一步评价其抗氧化活性，为南极磷虾的精深加工提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料

南极磷虾：由作业船在南极海域捕捞，捕捞后迅速保存在-30 ℃冰柜中，冷冻方式：运至实验室，贮藏于超低温冰箱中；动物蛋白水解酶(2×105U/g)：河北格贝达生物科技有限公司；羟基自由基清除能力试剂盒和总抗氧化能力试剂盒：北京索莱宝科技有限公司；细胞色素C(12400 Da)、抑肽酶(6511.44 Da)、维生素B12(1355.38 Da)、谷胱甘肽(612.63 Da)和胞苷(242.2 Da)：美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

Avanti JXN-30型冷冻离心机 美国Beckman Coulter公司；FreeZone 12型冷冻干燥机 美国Labconco公司；KjelFlex K-360型凯氏定氮仪 瑞士Buchi有限公司；UV-3100BPC型分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；超高效液相色谱仪(UPLC) 美国Waters公司。

1.3 南极磷虾虾糜和蛋白的制备

南极磷虾虾糜和蛋白为实验室自制，前者通过等电点沉淀法制备[5]，后者通过碱提酸沉法提取[6]，分别收集样品，冻干备用。

1.4 南极磷虾多肽的制备

以冻干南极磷虾虾糜粉和蛋白粉为原料，按液料比3∶1 (mL/g)加水复溶，调pH(7.0，7.5，8.0，8.5，9.0)，加入动物蛋白水解酶，加酶量为500，1000，1500，2000，2500 U/g，在不同温度下(40，45，50，55，60 ℃)保温1，2，3，4，5 h，酶解结束后沸水浴灭酶5 min。10000 g条件下离心15 min，取适量上清液，按1.5项下方法测定其水解度。其余上清液，冻干备用。

1.5 多肽水解度的测定

酶解上清液中可滴定氮含量参考邹大维等人的方法，通过甲醛固定、碱液滴定测定[7]。总氮由凯氏定氮法测定。水解度(%)按公式(1)进行计算：

水解度=游离氨基氮/总氮量×100%。

(1)

1.6 多肽分子量范围测定[8]

采用Waters ACQUITY UPLC I-Class(紫外检测器)对南极磷虾多肽的相对分子质量分布进行测定。色谱柱：Peptide CSH C18(130 Å，1.7 μm，2.1 mm×100 mm)。流动相A：含0.1%(V/V)三氟乙酸的超纯水，流动相B：含0.1%(V/V)三氟乙酸的乙腈。梯度洗脱条件：初始条件为2%的B，在20 min时将B增加到50%，维持6 min后，将流动相B调节至2%，总时间为30 min。检测波长214 nm和280 nm，柱温40 ℃，流速0.1 μL/min，进样量10 μL，进样浓度0.02 g/mL。样品分子量分布根据标准品保留时间确定。

1.7 羟基自由基清除能力测定

酶解冻干物用去离子水配成不同浓度(1.0～5.0 mg/mL)备用。羟基自由基清除测定参考试剂盒说明书进行。首先，将0.15 mL试剂1、0.4 mL试剂2和0.1 mL试剂3迅速混匀，防止局部颜色过浓。再加入0.25 mL样品和0.1 mL试剂4，混匀，37 ℃下温育60 min。反应结束后，10000 g离心10 min，测定536 nm下的吸光度值。空白组用去离子水替代样品和试剂4，对照组用去离子水替代样品。清除率按公式(2)计算：

清除率=(A样品-A对照)/(A空白-A对照)×100%。

(2)

1.8 总抗氧化能力测定

酶解冻干物用去离子水配成不同浓度(1.0～5.0 mg/mL)备用。总抗氧化能力测定参考试剂盒说明书进行。先绘制FeSO4浓度与反应吸光度变化(ΔA)的标准曲线。再将试剂1、试剂2和试剂3按7∶1∶1的比例混合，使用前预温至37 ℃。取上述混合液900 μL，加入30 μL样品(V样品)和90 μL去离子水，充分混匀，此时总体积为1.02 mL(V反应)，反应10 min，测定593 nm处的吸光度A测定。对照组用去离子水代替样品，测定得A对照。计算样品的ΔA=A测定-A对照，代入标准曲线计算得到对应的Fe2+浓度x(μmol/mL)。总抗氧化能力按公式(3)计算：

总抗氧化能力(U/mL)=(x×V反应)/V样品。

(3)

1.9 统计分析

所有实验重复3次，结果表示为平均值±标准偏差。实验数据均采用SPSS进行t检验和多重Duncan比较，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 温度对南极磷虾虾糜和蛋白酶解效果的影响

温度是影响动物蛋白水解酶活性的主要因素之一。本研究在pH 8.0、加酶量2000 U/g、酶解时间3 h的条件下，测定40～60 ℃下动物蛋白水解酶对南极磷虾虾糜和蛋白的水解度，结果见图1。

图1 温度对南极磷虾虾糜和蛋白水解效果的影响Fig.1 Effect of temperature on proteolysis of Antarctic krill surimi and protein

注：相同字母代表差异不显著(P>0.05)，下同。

由图1可知，动物蛋白水解酶对南极磷虾虾糜和蛋白的酶解效果随着温度的升高均呈现先上升后下降的趋势，50 ℃时水解度达到最大值。当温度低于50 ℃时，动物蛋白水解酶随着温度升高，反应速率加快，催化效率增强，水解度随之显著增大(P<0.05)；当温度高于50 ℃时，动物蛋白水解酶的活性降低，反应速率降低，水解度随之显著减小(P<0.05)。因此，选择50 ℃作为酶解最优温度，这与通过动物蛋白水解酶酶解单环刺螠体壁肌的研究结果一致[9]。

2.2 pH对南极磷虾虾糜和蛋白酶解效果的影响

与温度类似，pH也是影响动物蛋白水解酶活性的主要因素。本研究在温度50 ℃、加酶量2000 U/g、酶解时间3 h的条件下，测定pH 7.0～9.0下动物蛋白水解酶对南极磷虾虾糜和蛋白的水解度，结果见图2。

图2 pH对南极磷虾虾糜和蛋白水解效果的影响Fig.2 Effect of pH on proteolysis of Antarctic krill surimi and protein

由图2可知，动物蛋白水解酶对南极磷虾虾糜和蛋白的酶解效果随着pH的升高也呈现先上升后下降的趋势，当pH为8.0时，水解度达到最大值，当pH低于8.0时，动物蛋白水解酶活性随pH增大而增强，所以水解度随之显著增大(P<0.05)；当pH>8.0时，动物蛋白水解酶的活性降低，水解度随之显著减小(P<0.05)，因此，8.0为最佳酶解pH。徐锦等人研究了6种商品蛋白酶对鲢鱼蛋白的水解效果，同样发现动物蛋白酶的最优酶解pH为8.0，与本文的结果一致。

2.3 加酶量对南极磷虾虾糜和蛋白酶解效果的影响

加酶量是影响动物蛋白水解效率的重要因素。本研究在温度50 ℃、pH 8.0、酶解时间3 h的条件下，测定500～2500 U/g加酶量下动物蛋白水解酶对南极磷虾虾糜和蛋白的水解度，结果见图3。

图3 加酶量对南极磷虾虾糜和蛋白水解效果的影响Fig.3 Effect of additive amount of enzyme on proteolysis of Antarctic krill surimi and protein

由图3可知，当南极磷虾虾糜和蛋白原料底物充足时，动物蛋白水解酶的酶解效果随着加酶量的增加呈现显著增加趋势(P<0.05)，但当加酶量超过2000 U/g时，由于酶解底物蛋白量有限，水解度无显著性变化(P>0.05)。因此，确定2000 U/g为最优加酶量。

2.4 酶解时间对南极磷虾虾糜和蛋白酶解效果的影响

酶解时间是影响动物蛋白水解酶活性的因素之一。本研究在温度50 ℃、pH 8.0、加酶量2000 U/g的条件下，测定酶解时间1～5 h下动物蛋白水解酶对南极磷虾虾糜和蛋白的水解度，结果见图4。

图4 酶解时间对南极磷虾虾糜和蛋白水解效果的影响Fig.4 Effect of enzymolysis time on proteolysis of Antarctic krill surimi and protein

由图4可知，在前3 h内，动物蛋白水解酶对南极磷虾虾糜和蛋白的水解度随酶解时间的延长而显著增加(P<0.05)，然而，当时间超过3 h时，由于南极磷虾虾糜和蛋白得到了充分水解，水解度无显著性变化(P>0.05)。因此，确定3 h为最优酶解时间。戴志远等人从呈味角度分析了动物蛋白水解酶对梅鱼酶解的效果，发现充足的酶解时间(4 h)有利于鲜味游离氨基酸的获得，可提高产品的风味品质[10]。

2.5 南极磷虾多肽的分子量分布

图5 南极磷虾虾糜多肽和蛋白多肽的UPLC色谱图Fig.5 UPLC chromatograms of peptides derived from Antarctic krill surimi and protein

本文采用反相UPLC测定了南极磷虾虾糜多肽和蛋白多肽的分子量分布。随着酶解反应的进行，南极磷虾蛋白被水解成不同分子量肽段的混合物，其大小分布见图5。

由图5可知，动物蛋白水解酶水解南极磷虾虾糜和蛋白得到的多肽分子量集中在311～2963 Da之间。在波长214 nm下，2种原料来源的多肽都检测到分子量为311，347，606，971，1483 Da的多肽；在波长280 nm下，来自南极磷虾蛋白的样品额外检测到分子量为2963 Da的肽段。从分子量来看，本研究制备的南极磷虾多肽符合生物活性肽分子量范围大小(<6000 Da)，具有表现一定生物活性的潜力[11]。

2.6 南极磷虾多肽抗氧化活性

Sila和Bougatef发现水产品是生物活性肽开采的巨大资源，尤其是抗氧化肽，如三肽Ser-Cys-His、四肽Ala-Cys-Phe-Leu、五肽Gly-Ser-Gly-Gly-Leu等[12]。如2.5所述，本文制备的南极磷虾多肽具有一定活性潜力，因此，本文选取抗氧化性对其进行评价。

2.6.1 羟基自由基清除能力

图6 南极磷虾多肽的羟基自由基清除能力Fig.6 Hydroxyl radical scavenging capacity of Antarctic krill peptides

由图6可知，2种原料制备的南极磷虾多肽对羟基自由基的清除率存在显著差异(P<0.05)，并且随着浓度的升高而增大，这可能与两者组成的差异性有关。在多肽浓度为5.0 mg/mL时，羟基自由基的清除率最大，虾糜多肽为16.7%±1.2%，蛋白多肽为25.0%±1.5%。阳性对照组VC在浓度0.5 mg/mL时，羟基自由基的清除率为43.6%±1.5%，与阳性对照相比，南极磷虾多肽的羟基自由基清除能力较弱。

2.6.2 总抗氧化能力

图7 南极磷虾多肽的总抗氧化能力Fig.7 Total antioxidant capacity of Antarctic krill peptides

由图7可知，2种原料制备的南极磷虾多肽的总抗氧化能力随多肽浓度的升高而增大，但二者差异不显著(P>0.05)，在多肽浓度为5.0 mg/mL时，总抗氧化能力最大，虾糜多肽为(0.11±0.03) U/mL，蛋白多肽为(0.17±0.02) U/mL。阳性对照组VC在浓度为0.5 mg/mL时，总抗氧化能力高达(1.08±0.04) U/mL，与阳性对照相比，南极磷虾多肽的总抗氧化能力较弱。

3 结论

本文将动物蛋白水解酶制剂应用于南极磷虾虾糜和蛋白的制备得到具有一定抗氧化能力的生物活性肽。单因素实验表明最优的酶解温度为50 ℃，pH为8.0，加酶量为2000 U/g，酶解时间为3 h。在此条件下酶解，南极磷虾多肽的分子量范围为311～2963 Da，且具有一定的羟基自由基清除能力和铁还原能力。