14种香辛料提取物的多酚、黄酮含量及抗氧化活性比较研究

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(1.武汉轻工大学 生物与制药工程学院，武汉 430023；2.武汉轻工大学 食品科学与工程学院，武汉 430023；3.武汉食品化妆品检验所，武汉 430012)

香辛料是人们常用的一系列食品调味品，具有调和滋味、增进食欲、延长食品保质期等功效[1-3]，是日常食品烹调中不可缺少的一部分。近年来有研究表明，香辛料提取物具有良好的抗氧化活性[4-8]，相关研究也在不断进行中。随着人们对健康生活和食品品质的要求逐渐提高，人们开始考虑食品中添加的合成抗氧化剂对人体产生的不良影响，天然抗氧化剂已经成为国内外研究开发的热点。香辛料是重要的天然抗氧化剂的来源，本实验对14种香辛料的水提物、醇提物的抗氧化能力及与多酚、黄酮含量的相关性进行了研究，为香辛料天然抗氧化剂的开发和研究提供了参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

14种香辛料辣椒、花椒、桂皮、白芷、豆蔻、沙姜、草果、八角茴香、丁香、黑胡椒、香叶、甘草、陈皮、茴香：均购于武汉舵落口香料市场；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：购自上海TCI公司；芦丁标准品(rutin)、没食子酸标准品(gallic acid)：购自上海源叶生物公司；无水乙醇、邻苯三酚、Vc、亚硝酸钠、三氯化铝、氢氧化钠、福林酚、碳酸钠：均为国产分析纯；水：超纯水，实验室制备。

1.1.2 仪器与设备

SB-5200DTN超声波清洗器，SCIENT2-12N冷冻干燥机 宁波新芝生物科技股份有限公司；RE-3000A旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；A360紫外可见分光光度计 翱艺仪器(上海)有限公司；AR2140电子分析天平 奥斯特仪器有限公司；TG18M高速离心机 长沙平凡仪器仪表有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 香辛料提取物的制备

14种香辛料烘干后粉碎，过40目筛。准确称量50 g原材料，按 1∶10 (m/V)的料液比，使用体积分数为70%的乙醇溶液于50 ℃超声提取45 min，经80 ℃水浴回流提取3次，每次1 h；合并滤液，减压浓缩至浸膏状，冷冻干燥，得香辛料醇提取物，测试前使用70%的乙醇进行配制。准确称取香辛料粉末50 g，按1∶10 (m/V)的料液比，使用超纯水于50 ℃超声提取45 min，经80 ℃水浴回流提取3次，每次1 h；合并滤液，减压浓缩至浸膏状，冷冻干燥，得香辛料水提取物，测试前使用超纯水进行配制。

1.2.2 黄酮与多酚含量的测定

黄酮含量的测定：采用AlCl3-乙酸钾比色法[9]，稍作修改。配制梯度浓度为0.02，0.04，0.06，0.08，0.1 mg/mL的芦丁标准溶液。取2 mL待测液与0.3 mL 5%的亚硝酸钠溶液混合，6 min之后加入0.3 mL 10%的三氯化铝溶液，充分混匀反应5 min之后加入2 mL 1 mol/L的氢氧化钠溶液，待反应液充分混匀，15 min后于波长510 nm处测定不同浓度梯度芦丁标准液的吸光度，绘制标准曲线。

将提取物配制成浓度为0.4 mg/mL的待测液，按上述步骤测量吸光度，根据芦丁标准曲线计算黄酮含量。结果以每克提取物中含有的相当量芦丁毫克数来表示(mg/g)。

多酚含量的测定：采用福林-酚法[10]，稍作修改。配制梯度浓度为0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL的没食子酸标准溶液。取0.5 mL标准溶液与0.4 mL福林酚试剂与7.5 mL水充分混匀，5 min之后加入10%的碳酸钠溶液1.6 mL，待反应液充分混匀后于室温下避光反应2 h，于765 nm波长处测定其吸光度，绘制标准曲线。将提取物配制成0.4 mg/mL的待测液按上述步骤测量吸光度，根据没食子酸标准曲线计算黄酮含量。结果以每克提取物中含有的相当量没食子酸毫克数来表示(mg/g)。

1.2.3 DPPH自由基清除能力的测定

参考Adekoya等[11]的方法，稍作修改，配制为20，40，60，80，100 μg/mL的香辛料提取物待测液以及VC待测液。取2 mL待测液与2 mL 1×10-3mol/L的DPPH充分混合，室温下避光静置30 min后于517 nm处测定其吸光度。待测液对DPPH自由基的清除率按公式(1)计算：

DPPH自由基清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100。

(1)

式中：Ai为样品混合DPPH后的吸光度；Aj为样品与等体积溶剂混合后的吸光度；A0为DPPH与等体积溶剂混合后的吸光度。

1.2.4 超氧阴离子自由基清除率的测定

采用邻苯三酚自氧化法[12]，稍作修改。配制浓度梯度为1，2，3，4，5 mg/mL的香辛料待测液与VC待测液，取待测液1 mL于10 mL试管中，加入pH值为8.2的Tris-HCl缓冲溶液8.7 mL，随后加入0.3 mL 3 mmol/L的邻苯三酚溶液，迅速混匀后用紫外可见分光光度计测定 322 nm波长处的吸光度(以10 mmol/L的盐酸做参比溶液)。每隔1 min测1次，直到反应启动后第9 min将所得的数据以时间为横坐标、A322值为纵坐标进行线性回归，得到的直线斜率为反应速率V0，Vi。清除率按公式(2)计算：

K(%)=(1-Vi/V0)×100。

(2)

式中：Vi为不加待测液时的反应速率；V0为加入待测液时的反应速率。

1.3 数据统计分析

数据统计分析采用Microsoft Excel 2007、SPSS 4.0软件进行，数值表示为平均值±标准差。

2 实验结果与分析

2.1 香辛料提取物得率

14种香辛料所得的28种提取物得率见表1，同种香辛料的醇提物和水提物的提取率基本相当，辣椒、桂皮水提物和醇提物的提取率差异显著(P<0.01)。14种香辛料的提取率均在2.7%以上。

表1 14种香辛料水提物与醇提物的提取率Table 1 The extraction rates of 14 spices' aqueous extracts and alcohol extracts %

2.2 香辛料提取物中多酚、黄酮的含量

实验得多酚线性回归方程为：y=0.3395x-0.001(R2=0.9995)，黄酮线性回归方程为：y=1.333x+0.0223(R2=0.9991)。

14种香辛料水提物与醇提物的多酚和黄酮含量见表2。

注：同一列中上标字母不同表示差异显著(P<0.05)，下同。

由表2可知，28种香辛料提取物中，同种香辛料的醇提物和水提物间多酚、黄酮含量差异显著(P<0.05)。香辛料醇提物多酚和黄酮含量整体高于香辛料水提物，其中醇提物中黄酮含量明显高于水提物。丁香水提物中黄酮含量为(49.70±1.28) mg/g，而醇提物中含量为(97.65±1.91) mg/g，差异具有显著性(P<0.01)。丁香、桂皮、花椒、香叶、草果5种香辛料的水提物、醇提物的多酚、黄酮含量均较高，其中多酚含量在21.83 mg/g，黄酮含量在24.81 mg/g以上，与郭艳华等的研究结果相同。

2.3 香辛料抗氧化能力比较[13]

2.3.1 香辛料提取物DPPH自由基清除率以及量效关系

由图1和图2可知，香辛料提取物的DPPH自由基清除率随提取液浓度升高而逐渐提高，但清除效果大多低于阳性对照Vc。在浓度为100 μg/mL时，丁香、桂皮提取物与Vc的清除率基本相当，均大于90%；花椒、香叶、茴香提取物的清除率在85%以上。其中水提物中辣椒提取物的清除率最低，醇提物中山奈提取物的清除率最低。

由表3可知，14种香辛料提取物DPPH自由基清除率IC50值具有显著差异(P<0.05)，大多数香辛料水提物的IC50值高于相应的醇提物，且均高于Vc。如花椒醇提物的IC50值为(0.03±0.00) mg/mL，而水提物为(0.06±0.00) mg/mL。茴香醇提物的抗氧化能力明显低于水提物，茴香醇提物的IC50值为(0.07±0.00) mg/mL，水提物的IC50值为(0.19±0.01) mg/mL。DPPH自由基清除率较好的是丁香、桂皮、花椒、香叶、八角提取物，IC50值均低于0.05 mg/mL，具有良好的抗氧化能力。

2.3.2 香辛料提取物超氧阴离子自由基清除率以及量效关系

图3 香辛料水提物对O2-·自由基的清除效果Fig.3 O2-·free radical scavenging rates of spices' aqueous extracts

图4 香辛料醇提物对O2-·自由基的清除效果

由图3和图4可知，香辛料提取物超氧阴离子自由基的清除率随提取液浓度升高而逐渐提高，但清除效果大多低于阳性对照Vc。在提取物浓度为1 mg/mL时，Vc O2-·自由基清除率即达到64.98%，丁香水提物、醇提物的清除率均达到53%，在低浓度时即具有良好的清除率。在样品浓度为5 mg/mL时，丁香、黑胡椒、桂皮水提物的清除率均高于94%，与Vc的清除率相当，其中陈皮水提物、醇提物的清除率均为最低。

表4 14种香辛料水提物与醇提物超氧阴离子自由基清除率IC50值Table 4 IC50 values of O2-· free radical scavenging rates of 14 spices' aqueous extracts and alcohol extracts mg/mL

由表4可知，香辛料水提物O2-·自由基清除率IC50值总体上略高于醇提物。14种香辛料O2-·自由基清除率IC50值之间存在显著差异(P<0.05)，其水提物、醇提物的清除效果均弱于Vc，清除效果较好的5种香辛料为丁香、草果、桂皮、黑胡椒、豆蔻，其IC50值均低于3.6 mg/mL，具有一定的超氧阴离子自由基清除能力。清除效果最好的是丁香水提物，IC50值为(0.61±0.01) mg/mL。

2.4 相关性分析

表5 香辛料提取物多酚、黄酮含量与抗氧化能力之间的相关性Table 5 The coefficients among the content of polyphenols and flavonoids of spices' extracts and the antioxidant abilities

注：“*”表示在0.05水平上显著相关；“**”表示在0.01水平上显著相关。

由表5可知，香辛料水提物、醇提物的多酚含量与黄酮含量均与DPPH自由基清除能力显著相关(P<0.01)，其中醇提物黄酮与DPPH自由基清除能力的相关系数为0.855，高于水提物多酚含量与DPPH自由基清除能力的相关系数，可知香辛料DPPH自由基清除能力与黄酮含量更为相关。香辛料水提物、醇提物的多酚含量与超氧阴离子自由基清除能力显著相关(P<0.01)，水提物黄酮含量与其没有显著相关性，醇提物黄酮含量与其显著相关(P<0.05)，可知香辛料超氧阴离子自由基清除能力与多酚含量更为相关。两种不同的抗氧化模型更能体现香辛料的抗氧化活性。以上研究结果表明多酚与黄酮是香辛料提取物中抗氧化的主要成分。

3 讨论

生物体内自由基种类与反应机制不尽相同[14,15]，本次实验建立两种抗氧化模型以求更客观地体现香辛料提取物抗氧化能力的差异。实验结果显示：香辛料水提物与醇提物均存在一定的抗氧化能力，其中大多数醇提物DPPH自由基清除效果好于水提物，大多数水提物超氧阴离子自由基的清除效果好于醇提物。根据相关性分析表明，香辛料提取物中黄酮化合物与DPPH自由基清除率更为相关，香辛料提取物中酚类化合物则与超氧阴离子自由基的清除率更为相关，因此香辛料抗氧化能力应从两种化合物含量方面综合考量。

在14种香辛料中，丁香的抗氧化活性最好，DPPH自由基清除率IC50值为(0.01±0.03) mg/mL，超氧阴离子自由基清除率IC50值为(0.60±0.04) mg/mL，在低浓度时即拥有良好的清除率，同时多酚、黄酮含量较高，其中醇提物的黄酮含量为(97.65±1.91) mg/g，在同类香料中含量最高。除丁香外，桂皮、花椒也具有良好的抗氧化能力，醇提物的多酚含量大于50 mg/mL，醇提物的黄酮含量大于80 mg/mL，具有良好的开发前景。本实验研究了香辛料的抗氧化性与黄酮、多酚含量的相关性，为进一步研究、筛选香辛料提取物的抗氧化成分提供了借鉴，为天然抗氧化剂的开发提供了技术参考。