不同地区狗尾草及其植硅体碳氮同位素研究

李嘉嘉,左昕昕

（1.华南师范大学，广州510631；2.福建师范大学，福州350108）

1 引言

植硅体（phytolith），即植物硅酸体，也称蛋白石、植硅石，是植物生长过程中根系吸收土壤中的单硅酸［Si（OH）4］，沉淀在植物细胞壁、细胞腔内或细胞间的非晶质二氧化硅矿物［1-2］。植硅体中包含SiO2（66%—91%），H2O（1%—12%）和C、N、P、Al、Fe、Ca、K、Na、Mn、Ti、Mg、Cu 等成分［3］。植硅体在植物体内形成的过程中，包裹0.2%—5.8%的有机碳，这部分碳称为植硅体圈闭碳，即植硅体碳［4］。植硅体闭留的碳将持续千年以久，被认为是一种稳定的碳汇机制，对调节全球固碳、气候变化及重建具有深远的科研价值。目前国内外对植硅体碳的研究主要集中于植硅体碳含量［5-7］、封存潜力［8-10］、14C［11-12］测年等，而对植硅体碳氮同位素与气候因子的关系研究较少，其中未发现有关植硅体氮同位素的相关论述。

2 研究背景和问题

2.1 植物稳定碳氮同位素研究进展

碳素和氮素是植物生长的重要元素。国内外对植物碳氮同位素的研究较多，并取得了一系列的进展。

植物光合途径的不同（C3，C4和CAM 途径）是产生碳同位素组成不同的主要原因。C3植物δ13C值约为-20‰— -35‰（平均为-26‰），C4植物约为-7‰— -15‰ （平均为-12‰），CAM 植物约为-10‰—-22‰（平均为-16‰）［13］。研究表明植物体内的碳主要来自于大气中的CO2，植物进行光合作用合成植物体有机物质的过程中导致碳同位素的两次分馏：一是大气CO2通过叶片气孔向叶内扩散过程的动力分馏；二是CO2进入光合循环，合成有机物过程中的动力分馏，从而造成13C 值的降低［14-15］。通过对植物碳同位素组成研究，可区别植物的光合途径，为重建大气CO2浓度及δ13C 提供理论依据。国内外学者还对影响植物碳同位素组成的因素做了相关研究，发现植物δ13C与温度之间存在显著的相关关系，与降水量之间也存在相关关系，并可以算出降水系数。这些研究都说明了温度、降水等气候因子影响植物稳定碳同位素的分馏过程乃至植物稳定碳同位素组成［16］。

除少数固氮植物外，植物氮素主要来源于根系吸收土壤中的硝态氮和铵态氮，再经过同化还原作用固定在有机质中，这两个阶段都会产生氮同位素分馏［17］。植物吸收的氮同位素的种类和数量既与其生长的土壤条件有关，而且与气候环境变化所引起的植物生理代谢过程的改变密切相关［18］。因此，植物氮稳定同位素的组成一定程度上反映了土壤氮素的积累以及气候变化。为了探明气候对植物氮同位素的影响，国内外学者对此展开了重多研究，但研究结果并非一致。刘晓宏［19］等研究发现，东非大裂谷埃塞俄比亚段内C3植物的δ15N 与年均温度呈极显著正相关，温度每增加1℃，植物δ15N 偏正0.5‰。而刘卫国［20］等对黄土高原的研究结果却表明黄土高原植物根系、植物残体的δ15N值随年均温度和生长季温度（6～8月）增加呈现偏负的趋势。Craine［21］等提出，在全球尺度上植物δ15N 与年均温度并不是简单的线性关系。Handley［22］等通过调查全球陆地植物δ15N与降水量的关系，发现植物的δ15N随降雨量增加而变轻，即植物δ15N 与年均降水量呈显著负相关关系。大多数研究都得出类似的结论，但个别研究的结论相反，Heaton［23］研究发现，生长在纳米比亚海岸带高降水量的植物δ15N比附近干旱地区的植物δ15N偏正5‰。

因此，通过植物碳氮同位素组成的研究，了解其生长环境中碳氮输入、转化和输出，获得气候环境变化的信息，成为重塑古气候环境和认识现代气候环境变化的有效手段。

2.2 植硅体稳定碳氮同位素的研究进展

植硅体稳定同位素分析表明，植硅体是植物通过吸收单硅酸，以蒸腾作用为主要动力，在植物的不同部位发生同位素分馏淀积形成，其稳定同位素组成具有丰富的植物生理和环境信息［24］。

几乎所有的植物生物量碳（＞97%）均来自光合作用固定的大气CO2，植硅体中包裹的碳也不例外［25］。Kelly［26］等发现植硅体碳同位素组成与其各自植物碳同位素组成之间存在紧密的联系（R2=0.93，P＜0.01），植硅体碳则显著的偏负于植物碳。但因植物种类的不同，植硅体的偏负存在一定差异。研究表明木本植硅体碳同位素与植物总有机碳的差值大小接近，略有偏正；草本植硅体碳同位素偏负于植物总有机碳，且C4植物比C3植物偏负程度大［27-28］。王永吉［29］等对我国现代植物和土壤植硅体碳同位素进行了研究，发现C3、C4植硅体的碳同位素值与其植物的碳同位素值具很好的对位关系，植硅体的碳同位素可以明确地区分出植物的光合作用途径，反映C3、C4植物沿纬度分布的规律性。Carter［30］等还利用植硅体碳封存进行了研究古大气二氧化碳碳同位素组成。因此，基于植硅体碳来源于大气CO2，利用植硅体稳定碳同位素来重建古大气中CO2的变化，将古气候、古植被重建等推向更深入的研究层次，还反映地层沉积物中的古环境信息，对于生态学和地质学具有重要意义。

正如植物稳定碳同位素组成能够反映温度、湿度和降水量等环境因素，植硅体δ13C值理论上也应该具有记录环境因素的变化的潜力。但对于植硅体碳氮同位素组成与气候因子关系的研究不多。Webb和Longstaffe［31］对北美大草原中典型的C4植物长叶紫珠进行植硅体δ13C值与环境因素的关系，结果表明植物茎鞘中植硅体的δ13C 值与湿度（r2=0.3）、纬度（r2=0.4）和降水量（r2=0.5）具有显著的相关性。而各组织中的植硅体δ13C值与温度的相关性都不明显（r2＜0.5），且同一地区样品中组织器官间的植硅体δ13C值存在差异。关于植硅体氮同位素，还未发现有关的研究，因此植硅体氮同位素的组成及其与气候因素的关系也是本文研究的一个方向。

综上所述，现今国内外学者对植物碳氮同位素和气候因素对其组成的影响作出了许多的研究，但以狗尾草作为实验材料的研究很少。而对植硅体碳的研究主要集中于解释其来源、含量方面，前人更是未曾对植硅体氮同位素作出相关的研究。植物硅酸体碳氮同位素变化与气候两大因素-气温和降水的变化是否存在明确的关系，目前还了解甚少。由于C4禾本科植物狗尾草（Setaria viridis）在全国分布面积广泛，采集简单，而且其植硅体含量较丰富，故本文以狗尾草作为实验材料进行研究。本文采样点的选取为广东吴川、福建福州、湖北武汉、湖北襄阳、河南许昌、河南开封。由于六处采样点狗尾草分布广泛，易于采集，而且从南到北年平均气温逐渐降低，年平均降水量逐渐减少，有利于研究分析。通过采集该六个不同地区的狗尾巴草植株，利用湿式灰化法分别提取植硅体，进行植物和植硅体碳氮同位素的检测分析，从而探究不同地区狗尾草植物和植硅体碳氮同位素之间的差异和关系，以及它们对气候因素变化的响应，为重建气候提供基础的理论依据。

3 研究区域和方法

3.1 研究区域的概况

本次研究分别从广东吴川、福建福州、湖北武汉、湖北襄阳、河南许昌、河南开封六个不同地区进行狗尾草样品的采集。

吴川市地处广东省西南部，位于鉴江平原上。气候为亚热带季风气候，年平均气温为23.6℃，年平均降雨量为1 598.8 毫米，日照充足、热量丰富、高温多雨。该地狗尾草的样品采集于北纬21°45′7″，东经110°4′22″。

福州市地处福建省东部，位于闽江下游及沿海地区。气候为亚热带季风气候，年平均气温为20.7℃，年平均降水量为1 374.7 毫米，阳光充足，雨量充沛。该地狗尾草的样品采集于福建师范大学仓山校区校内。

武汉市地处湖北省东南部，位于江汉平原东部、长江中游。气候为亚热带季风气候，年平均气温为16.5℃，年平均降水量为1 260.7 毫米，日照充足、四季分明。该地狗尾草的样品采集于武汉大学校区内，采集了青狗尾草和金色狗尾草两种样本。

襄阳市地处湖北省西北部，位于汉江中游平原腹地。气候为亚热带季风气候，年平均气温为15.5℃，年平均降水量为834.9 毫米，日照充足，四季分明。该地狗尾草的样品采集于北纬31°43′22″，东经112°15′13″，海拔60米。

许昌市地处河南省中部，位于伏牛山余脉向豫东平原的过渡带。气候为暖温带季风气候，年平均气温为14.5℃，年平均降水量为726.3 毫米，光照充足，热量资源丰富。该地狗尾草的样品采集于北纬34°4′10″，东经113°58′47″，海拔60米。

开封市地处河南省东部，位于黄河下游南岸之滨。气候为暖温带季风气候，年平均气温为14.5℃，年平均降水量为627.5毫米，四季分明。

3.2 研究方法

3.2.1 样品采集 研究样品采集时间为2018年7—9月。采样点为广东吴川、福建福州、湖北武汉、湖北襄阳、河南许昌、河南开封。采样点从南向北年平均气温从23.6℃逐渐降低至14.5℃，年平均降水量从1 598.8毫米逐渐减少至627.5毫米。

在六个样点进行狗尾草样品的采集，采样点的选择为平坦、开阔的非耕地上，采集样品均为生长状况良好且带穗的（易于鉴定）健康植株10株，采集时将狗尾草植株连同根系拔起，获得完整植株，并做好包括采样时间、地点、品种等的详细记录。将采集的植株进行清洗，通风处晾干3—5天，之后将样品装袋、贴上标签。

3.2.2 样品预处理 选取采集后晾干的不同地区的样品5—7株，去除根部，剪成10 cm左右置于烧杯中，用超纯水辅以玻璃棒搅拌清洗6—7 遍，直至滤液澄清。清洗后的样品置于烘箱中，以70℃烘干（8 h）。将烘干后的样品剪成段约1 cm。

将剪碎的样品均匀混合，用勺子勺取1—2 g样品置于玛瑙研磨体中，研磨至粉末状，转移于小试管中，用于植物碳氮同位素的检测。

3.2.3 狗尾草植硅体的提取 本文采用传统成熟的湿式灰化法提取狗尾巴草植硅体，但略有修改，旨在完全氧化样品中的有机质。

具体步骤如下：

①将剪碎的样品，用高精度天平（精确度0.001 g），定量称取3—5 g 样品置于烧杯中，待氧化；

②向烧杯中滴加浓硝酸，于电热板上220℃加热（2.5 h），使之充分反应；

③静置溶液直至上清液澄清，倒掉上清液，剩余样品转移至离心管中，利用离心机离心4—5次（每次离心时间均为8 min，2 500 转/min），直到上清液澄清透明；

④将70ml 的浓盐酸稀释至250 ml，分别等量滴加于样品中；

⑤将样品放于电热板上220℃水浴加热（30 min）；

⑥将样品用蒸馏水清洗离心4—5 次（每次离心时间均为8 min，2 500 转/min），直至上清液呈中性；

⑦向样品中滴加30 ml双氧水，静置一夜；

⑧将样品用蒸馏水清洗离心4—5 次（每次离心时间均为8 min，2 500 转/min），直至上清液呈中性；

⑨烘箱以70℃烘干样品（6 h）；

⑩用夹子取1—2 g 样品置于玛瑙研磨体中，研磨至粉末状，转移于小试管中，用于植硅体碳氮同位素的测试。

3.2.4 狗尾草及其植硅体稳定碳氮同位素测定

用高精度天平（精确度0.001 mg），定量称取约3 mg 样品进行包样，用于稳定碳同位素的检测。用高精度天平（精确度0.001 mg），定量称取约0.1 mg 样品进行包样，用于稳定氮同位素的检测。采用稳定同位素质谱仪（Thermo Scientific MAT-253，USA）测定植硅体稳定碳氮同位素，测定工作在福建省湿润亚热带山地生态国家重点实验室（省部共建国家重点实验室培育基地）稳定同位素比率质谱实验室完成。

3.2.5 数据处理 将本文的结果数据进行平均值、标准差分析，并绘制统计图进行多重比较。数据的统计分析均在Microsoft、Excel 等软件上进行。

4 结果与分析

4.1 不同地区狗尾草植硅体百分含量和稳定碳氮同位素

表1给出了不同研究地区的年平均气温和年平均降水量、狗尾草植硅体百分含量以及稳定碳氮同位素数值。不同地区的狗尾草植硅体百分含量变化较小，变化范围为3.012—5.747%，平均值为4.796%，标准差为0.818%。

表1 不同地区气候、狗尾草样品基本参数和稳定碳氮同位素值Tab.1 Climate in different regions，basic parameters of samples，stable carbon and Nitrogen Isotope value of setaria viridis

稳定碳同位素在不同研究地区的狗尾草及其植硅体中变化不显著，植物碳同位素值变化范围为-12.1‰— -14.1‰，均值为-13.1‰，标准差为0.6‰，其中福建福州狗尾草最高-12.1‰，湖北武汉狗尾草最低-14.1‰；植硅体碳同位素值变化范围为-12.4‰ — -14.6‰，其中湖北襄阳狗尾草最高-12.4‰，湖北武汉狗尾草最低-14.6‰，均值为-13.0‰，标准差为0.7‰。稳定氮同位素值在不同研究地区的狗尾草及其植硅体中变化较大，植物氮同位素值变化范围为-0.1‰ — 4.2‰，均值为0.9‰，标准差为2.6‰；植硅体氮同位素值变化范围为-1.5‰ — -6.6‰，均值为-4.4‰，标准差为1.7‰。

4.2 不同地区狗尾草植物和植硅体碳氮同位素的相关性

植硅体碳同位素与植物碳同位素组成有很好的相关性，并且因植物种类的不同而存在一定差异［24］。

从不同研究地区狗尾草样品中提取的植物及其植硅体碳氮同位素值（δ13C‰）显示出不同程度的分馏（表1，图2和图3）。总的来说，不同地区狗尾草植物和其植硅体碳同位素值有很好的正相关性，线性回归方程为为y=0.771 4x-2.912 9（R2=0.429 5，P＞0.05）；植物和植硅体氮同位素相关性不明显。植物碳同位素平均值为-13.097‰，标准差为0.586‰；植硅体碳同位素平均值为-13.015‰，标准差为0.689‰；植物氮同位素平均值为0.937‰，标准差为2.602‰；植硅体氮同位素平均值为-4.387‰，标准差为1.712‰。

图1 狗尾草采样点示意图Fig.1 Sketch of sampling points of setaria viridis

狗尾草植物与植硅体碳的平均碳同位素分馏效应平均值为3.661‰。狗尾草植物与植硅体氮的平均碳同位素分馏效应平均值为5.324‰。结果表明，狗尾草植物和植硅体碳同位素相关性较好，而植硅体碳同位素值相比于植物碳同位素值偏负。

5 讨论

5.1 不同地区狗尾草植物和植硅体碳氮同位素值的关系

碳素是植物在生长发育过程中重要的营养元素。植物通过叶片从大气中吸收CO2进行光合作用合成植物体的有机物质，在此过程中导致碳同位素的两次分馏［33］。由于植硅体是植物体内无定形、微观可见的硅质细胞，在其形成过程中会包裹一定的碳，具有植物母体碳同位素组成的特征。Kelly［26］等研究表明，植硅体碳同位素与各自植物碳同位素相比，植硅体则明显偏负。而本文研究发现，狗尾草植物和植硅体碳同位素相关性较好，产生这种差异的原因可能与提取植硅体的植物材料以及植硅体的提取方法有关。消化性能力强的提取植硅体的方法，如干灰化法和碱溶分光光度法等，破坏了植硅体中的碳，从而影响其碳同位素的值。而本文植硅体的提取，采取的是稍作改良后的湿式灰化法，对植硅体中的碳破坏性较弱，因此反映出植硅体碳同位素很好地继承了植物碳同位素。

研究表明，狗尾草植物和植硅体氮同位素正相关性不明显，植硅体作为植物的一部分，其与植物总体氮同位素值关系微弱。猜测可能在植硅体的提取实验中，浓硝酸对其δ15N 产生一定影响。其实植物从土壤中吸收氮素的过程，本身对稳定氮同位素的分馏较小，然而植物获取氮素的来源不同造成了不同植物具有不同稳定氮同位素组成［33］。因此，不能直接用植硅体氮同位素值替代植物氮同位素值的水平。研究结果显示，氮同位素在进入植硅体的过程中发生了分馏，而且植硅体碳同位素值相比于植物碳同位素值偏负，虽然不能直接用植硅体氮同位素值代替植物碳同位素值，但可以通过大量的工作建立植物植硅体氮同位素之间的相关系数和方程。

图2 狗尾草碳同位素分析记录Fig.2 Carbon isotope analysis records from setaria viridis species

图3 狗尾草氮同位素分析记录Fig.3 Nitrogen isotope analysis records from setaria viridis species

5.2 气候因子对狗尾草及其植硅体碳氮同位素值的影响

气候是影响植物生长的重要因素，降水量与气温是气候的两大基本要素。降水量和气温是对不同地区狗尾草植物碳氮同位素值的影响因素。Amundson 等［32］的研究表明，全球尺度上植物氮同位素组成与温度和降雨量均相关。

温度影响植物的光合作用、呼吸作用、蒸腾作用等代谢过程进而影响植物碳氮同位素的分馏。研究发现，年均气温与狗尾草植物碳同位素值相关性不明显，为R2=0.290 7（P＜0.01），证实了C4植物的碳同位素组成对温度的敏感度较小［34］。温度也是影响植物氮同位素变化的重要因素，但是关于植物氮同位素与温度的关系，研究结果并不一致。多数研究表明，随着温度升高，植物δ15N值有变重的趋势［35］。而本文研究发现，气温与狗尾草植物氮同位素值有弱的负相关性（图4），为R2=0.360 5（P＜0.01），表明随着年均气温的升高，植物氮同位素值逐渐偏负，这个结果和刘卫国［20］等对黄土高原的研究结果相似。对此结合周咏春［22］等人的研究认为，本研究区域为季风区，与黄土高原的气候一样存在“雨热同期”的效应，增加降水影响导致植物氮同位素组成偏负效应大于受温度增加导致的植物氮同位素组成偏正的效应。因此，要真正了解植物δ15N与温度的关系，分离降水对δ15N的影响尤为必要。

图4 气温与狗尾草氮同位素值的相关性Fig.4 Correlation between temperature and nitrogen isotopes of setaria viridis

研究表明，年均气温与狗尾草植硅体碳同位素值不具相关性，R2=0.023 3（P＜0.01）。表明了狗尾草植硅体碳同位素值对温度的敏感度也很小，与Webb 和Longstaffe［31］对长叶紫珠各组织中的植硅体δ13C值与温度的相关性的研究结果一致。因此猜测，随着气温的升高，植物叶片气孔关闭，以防止水分流失，可能是由于水分利用效率低、养分消耗或非理想生长温度等原因导致植物对δ13C的分馏相应的减小，从而使叶片合成的有机物具有偏正的δ13C值，但这种影响很微弱。然而，气温与狗尾草植硅体氮同位素值有显著的负相关性（图5），为R2=0.570（P＜0.01）。表明，植硅体氮同位素值随气温的升高而偏负，猜测是因为由于气温的升高，细胞活性增加，促进了植物对δ15N 的分馏。

图5 气温与狗尾草植硅体氮同位素值的相关性Fig.5 Correlation between temperature and nitrogen isotopes in phytolith of setaria viridis

水是植物体重要的组成部分，是植物生命活动不可缺少的重要环境因素之一。降水量影响植物水分的吸收、新陈代谢等。本次研究表明，降水量与狗尾草植物氮同位素值成弱的负相关性（图6），为R2=0.367 3（P＜0.01），说明随着降水量的增加，植物氮同位素值呈偏负的趋势。C4植物因其独特的CO2固定方式，受水分的胁迫相对较小，故而与降水关系并不十分明确，可能其他环境因子对C4植物的碳同位素组成的影响更大，这还需要进一步的研究［33］。在很多区域都发现植物δ15N值随年均降水量的增加而减小，即湿润地区的δ15N值小于干旱地区［35］，本文研究结果与上一致。但是降水增加引起植物δ15N降低的机理尚未探明。周咏春［35］等认为降水可能影响土壤有机N 库向无机N 库转化以及无机N 损失，从而影响植物δ15N。研究发现，年均降水量与狗尾草植物碳同位素值不具有相关性，R2=0.015（P＜0.01），而前人的研究表明降水量与植物δ13C存在相关关系，产生此差异的原因可能是实验材料的不同。前人主要探究树轮的δ13C，而本文以草本植物狗尾草为实验材料。

图6 降水量与狗尾草植物氮同位素值的相关性Fig.6 Correlation between precipitation and nitrogen isotopes of setaria viridis

研究表明，年均降水量与狗尾草植硅体碳同位素值之间没有明显的相关性，R2=0.221 7（P＜0.01），与Webb 和Longstaffe［31］对长叶紫珠的研究中的结果有差距。产生差异的原因可能是样品材料以及样品数量所导致的。本文研究提取的是整株植物的植硅体，而Webb 和Longstaffe［31］是以植物茎鞘中的植硅体作为实验材料，加上本文研究的样品数量较少，因此研究结果与前人研究结论产生偏差。研究发现，年均降水量与狗尾草植硅体氮同位素值也没有显著的负相关性，R2=0.289 8（P＜0.01）。这可能是因为降水量是狗尾草植硅体碳氮同位素的组成的间接影响因素，其会影响空气中的CO2含量以及土壤氮的条件，进而影响植物的光合作用以及对氮的吸收。

综合考虑，气温与狗尾草δ13C 可能不具相关性，与δ15N 有弱的相关性；与植硅体δ13C值相关性不明显，与δ15N有较好的相关性。降水量与狗尾草δ13C 可能不具相关性，与δ15N 值有弱的相关性；与植硅体碳氮同位素值相关性不明显。故气候因素与狗尾草植物和植硅体碳氮同位素的关系还需深入探究。

6 结论

（1）通过对不同地区狗尾草碳氮同位素的研究，发现植物与植硅体碳同位素值有很好的相关性，说明植硅体对植物碳具有一定的继承性；而植物与植硅体氮同位素值相关性不明显，则不能用植硅体氮代替植物氮同位素值。

（2）气候两大重要因素气温和降水量对植物和植硅体碳氮同位素关系复杂，其中植硅体氮同位素值可作为气温变化的衡量指标，而植物碳氮、植硅体碳同位素值不能很好地体现对气候的响应，不能代表一地的气候特征。

7 不足与展望

本研究通过在六个不同地区采集狗尾草样品，探究狗尾草植物和植硅体碳氮同位素的关系以及其对气候的响应，但由于受到实验条件和试验时间的限制，本研究尚存在一些不足之处，有待作进一步的研究。

（1）本研究得出狗尾草植硅体氮同位素与气温具明显相关性，可建立植硅体氮素与气温的参数关系，但由于本次研究样品采集涉及的地区较少，样品数量较少，未有能力建立起此参数关系。在今后的研究中，样品采集应该选取气温变化梯度更大的地区，以减小误差使实验数据更加具有代表性、准确性。

（2）本研究揭示了狗尾草植物和植硅体碳氮同位素的关系，发现狗尾草碳同位素对气候的响应不是很明显，但该结论的产生原因尚未探明。在今后的研究中，应该重点关注植物和植硅体碳氮同位素积累的发生机理，并且运用控制单一变量法对狗尾草碳氮同位素与气候关系进行进一步实验探究。