甜菜红素合成相关基因不同时期叶片表达情况分析

鹿 尧，姚 磊，代翠红，李新玲，张延明

(1.东北农业大学国家大豆工程技术研究中心，哈尔滨 150028；黑龙江省绿色食品科学研究院，哈尔滨 150028；2.哈尔滨工业大学化工与化学学院，黑龙江 哈尔滨 150086；3.哈尔滨师范大学生命科学与技术学院，黑龙江 哈尔滨 150020)

0 前言

叶用甜菜通过丝绸之路传入我国，早已在我国南方及中原地区种植。植株生长前期叶片嫩时可以作为蔬菜食用，生长后期叶片或茎秆可作为家禽或家畜饲料。甜菜色素最早在食用甜菜根中被发现而得名[1]。甜菜色素又包括甜菜红素和甜菜黄素[2]。甜菜红素是一种水溶性天然色素，具有良好的着色性能，可用于食品，饮料着色等[3]。甜菜红色素在制药方面经常被添加进儿童服用的药品中或者为了药品便于区分而被加入药中[4]。因甜菜红素具有抗癌与抗氧化性在我国已开展了抗癌性药物的研发，并且我国科研人员通过探讨甜菜红色素对小鼠抗辐射的保护作用及机制发现了红色素的抗辐射功能[5]。甜菜红素的生物合成途径主要有两条：一是由环多巴甜菜醛氨酸的糖基化衍生而来的，另一条途径是由闭环多巴先进行糖基化再与甜菜醛氨酸缩合[3,6]。在此合成途径中含有三种关键酶酪氨酸酶、葡糖基转移酶和4，5-DOPA-双加氧酶[7,8,9]。酪氨酸酶可以精确的调控红色素的形成，可以精确到时间甚至组织，目前除在甜菜中鉴定出，还在盐地碱蓬中也被鉴定出[10]。葡糖基转移酶也是红色素合成过程中不可缺少的酶，其与色素的形成具有相关性[11]。4，5-DOPA-双加氧酶是甜菜红色素合成途径末端的关键酶，研究表明该酶的酶活与甜菜积累的量呈正相关[12]。本实验研究与甜菜红色素合成密切相关的基因表达量在不同时期的变化来探究甜菜红素合成代谢分子机理。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 甜菜材料

食用红甜菜，由哈尔滨工业大学自育的食用甜菜品种工大食甜1号。

1.1.2 主要试剂与仪器设备

Trizol购自美国英杰生命技术有限公司；氯仿、异丙醇、无水乙醇购自天津市永大化学试剂有限公司；DNA酶购自普洛麦格生物技术有限公司；西班牙琼脂糖购自北京沃比森科技有限公司；TAE购自北京索莱宝科技有限公司；EB 购自西格玛公司；反转录试剂盒和荧光定量预混液购自Applied Biosystems®ABI；检测引物由华大基因合成；DL2000 Marker购自日本Takara公司。

电子分析天平(BSA223S)购自赛多利斯(北京)科学仪器有限公司；电热恒温培养箱(DHP-9052)购自上海益恒科学仪器有限公司；高速冷冻离心机(D-37520)购自德国Heraeus公司；低速离心机(TGL-16G)购自上海安亭科学仪器厂；微波炉MM721AAU-PW(X)购自美的微波炉电器制造有限公司；电泳仪电源(DYY-6C)购自北京六一仪器厂；Super Clean Bench(SW-CJ-2FD)购自苏州安泰空气技术有限公司；微型电泳槽(DYCP-31BN)购自北京六一仪器厂；基因扩增仪(Hema3200)购自珠海黑马医学仪器有限公司；荧光定量PCR仪(CFX96)购自美国伯乐BIO-RAD；可见紫外分光光度计(WFZ UV-2100)购自尤尼柯(上海)仪器有限公司；Micro Drop 分光光度计(Bio-dl)购自上海宝予得科学仪器有限公司；超声仪(SD-5200D)购自宁波新芝生物科技股份有限公司；4℃/-20℃冰箱(BCD-160TMPQ)购自青岛海尔特种电器有限公司；灭菌锅(SXQ-DSX-280B)购自上海中安医疗器械厂。

1.2 实验方法

1.2.1 食用红甜菜品种及播种：

品种：工大食甜1号。

播种：4月25日播种，种植地为哈尔滨工业大学学府校区试验地。前茬大豆，秋起垄，秋施底肥二氨为225 kg/ha，种肥二氨为180 kg/ha。疏苗1次，定苗1次，三产三趟。防虫害防除根据实际发生情况防除2次。

1.2.2 取样及冻存

本实验所用的甜菜样品从长出第二对真叶开始取样，每增加1对真叶取样1次，至第7对真叶共计取6次； 7对真叶期后；所有后续样品每半个月取一次样，取样3次。共计9个样品。每次取样后将清洗干净的红甜菜叶样品用袋子密封后放入-20℃冰箱中保存备用[13]。

1.2.3 总RNA的提取

本实验采取Trizol法提取总RNA，具体步骤参照说明书。

1.2.4 RNA浓度测定

使用Micro Drop分光光度计进行测量，样品测量前先进行空白校正，用移液枪取2 μL纯水置于下光纤头上，校正基线。随后依次测量提取的样品，吸取1 μL混匀的样品，枪头贴着下光纤表面打出样品，在260 nm和280 nm紫外光波长下，测定该样品的光密度值，记录检测数据。

1.2.5 琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量

制备2%琼脂糖凝胶，称取0.4 g琼脂糖置于锥形瓶中，加入20 mL 1×TAE，在微波炉中加热煮沸3次至琼脂糖全部融化，摇匀，冷却至60℃，加入1 μL EB倒入制胶槽内。室温下静置直至凝胶完全凝固，垂直轻拔梳子，将凝胶及内槽放入电泳槽中。添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止。取1 μL总RNA与0.5 μL上样缓冲液吸打混匀，点入点样孔。盖好电泳槽盖，接通电泳仪电源与电泳仪之间的电泳导线，设定电压为120 V，电泳时间约为30 min，直至溴酚蓝指示带接近分离胶底部，切断电源，电泳完毕。在紫外透射仪中观察结果。

1.2.6 RNA的反转录

使用罗氏反转录试剂盒反应体系，具体操作如下；

(1)使用前将所有冷冻试剂解冻，开始试验前将所有试剂轻度离心，实验开始后保持所有试剂置于冰上。

(2)将无菌、无核酸酶、薄管壁的PCR管置于冰上，以20 μL反应体系为例，按表1准备模板-引物混合物。

表1 反转录反应液的配制

(3)在反应管中将试剂小心混匀。注意：不要涡旋！将反应管轻度离心使样本收集于反应管底部。反应时使用带热盖的加热模块，防止反应管中的液体挥发。

(4)按照表2设置反应条件

表2 反转录反应条件

将反应管放入基因扩增仪中，按设定好的程序运行。

1.2.7 荧光定量PCR

将反转录后的cDNA稀释2倍，作为模板，然后按表3组份，在冰上配制PCR反应液。将上述混合液反复吸打混匀后加入八连管，小心盖上透明盖，避免指纹粘上需更换新的塑料手套。使用低速离心机短时间离心后将八连管放入实时定量PCR仪中，按照设定好的程序运行。

表3 荧光定量反应液的配制

1.2.8 琼脂糖凝胶电泳检测荧光定量产物

取荧光定量PCR产物5 μL，混合1 μL的上样缓冲液，制备琼脂糖凝胶，浓度1%。按照琼脂糖凝胶电泳的操作方法进行电泳实验，然后在紫光灯下检测电泳结果并拍照。

1.3 甜菜红素合成相关基因特异性引物的设计

查阅文献发现与甜菜红色素生物合成途径中，主要有三个基因参与红色素的合成：酪氨酸酶基因、葡糖基转移酶基因和4,5-DOPA-双加氧酶基因[14]。在甜菜cDNA文库中进行BLAST比对，找到对应的基因序列，交由华大基因公司设计并合成荧光定量基因检测引物。本实验所用的特异性引物序列如表4所示。

表4 甜菜红色素合成相关基因引物的序列设计

引物合成后，用离心机12 000 rpm离心10 min，在超净工作台中打开稀释。用 DEPC处理后高压灭菌过的水按说明书稀释成浓度为100 pmol/μL的母液备用，-20℃保存备用。从稀释过的引物中再抽取50 μL加450 μL DEPC处理过的H2O稀释成10 pmol/μL用于实验。

2 结果与分析

2.1 不同时期食用红甜菜叶片总RNA的提取

在Trizol法提取RNA的基本操作中，添加了DNA酶处理及氯仿再次抽提的步骤，这可以使提取出来的RNA中基因组DNA及蛋白质的含量降低很多，进而保证提取出来RNA样品的质量。RNA样品电泳后得到琼脂糖凝胶电泳图，如图1所示。

图1 红甜菜不同时期叶片的总RNA电泳图

由图1(a)(b)可知，红甜菜叶片所提取的大部分样品RNA都没有降解，18S和28S条带清晰、整齐可见，样品的RNA完整性均很好，因此九个样品的RNA都可以用于后续反转录实验。

2.2 RNA浓度和纯度的检测分析

取1 μl DEPC处理过的水作为空白对照，后将所提取全部RNA各取1 μl点样在下光纤表面，用Micro Drop 分光光度计检测在260 nm和280 nm紫外光波长下，测定该样品的浓度和纯度，记录检测数据。

由表5可知所有样品的纯度均很高，很多样品260/280的比值非常接近于2.0。同时，由前文所列的电泳图也可看出所有样品的RNA的完整性较高，因此这些RNA样品均可用于后续实验。

表5 所有样品RNA浓度及纯度测定

2.3 RNA的反转录及转录后产物稀释

将提取后的RNA根据测定的初始浓度进行统一调整，分别加DEPC处理后的水，将所有RNA样品浓度调整至500 μg/mL，以便在后续反转录实验中便于计算和加样。将9个 RNA样本按照cDNA反转录试剂盒说明书进行反转录。然后随机取一个样品进行电泳检测，由电泳图可知，2号泳道中出现弥散的条带，这是由长度不同的cDNA构成，说明反转录成功。

图2 反转录样品的电泳检测

随机选取其中的两个cDNA产物原液，用内参基因ICDH初步检测一下其荧光定量效果，初步检测其Ct为22左右，由于Ct值不是很高，所以在做荧光定量时只把cDNA做了2倍稀释，用于荧光定量的cDNA模版。

2.4 叶片不同时期三种基因的表达情况

2.4.1 酪氨酸酶基因的表达

以同品系红甜菜不同生长时期的叶片作为研究对象，将9个时期的样品进行了qRT-PCR检测，以ICDH基因为内参基因，对三个基因进行相对表达量的分析，最终结果分别如图3、4、5所示。

注：1.二对真叶期 2.三对真叶期 3.四对真叶期 4.五对真叶期 5.六对真叶期 6.七对真叶期 7.七号样品(7月11日采样) 8.八号样品(8月8日采样) 9.九号样品(8月22日采样)图3 酪氨酸酶基因在甜菜不同生长期表达差异分析

由图3可见，在九个取样时期，前三个时期(即从二对真叶期到四对真叶期)，酪氨酸酶基因的表达一直处于上升趋势，并在四对真叶期时相对表达量达到顶峰，相对表达量达到2.5，之后的6个时期，酪氨酸酶基因的表达量呈现出明显的下降态势，并在七对真叶期以后表达量显著下降，都低于0.5；由此分析叶片中的酪氨酸酶基因主要在食用红甜菜的生长早期(五对真叶期以前)有较高的表达。但是否对色素合成油作用尚不明确。

2.4.2 葡糖基转移酶基因的表达

由图4可见，在九个取样时期，葡糖基转移酶基因均有不同程度的表达，在三对真叶期出现了相对表达量高峰，表达量达到近2.5，但在第四对真叶期葡糖基转移酶急剧下降，约为前一个时期的1/5，此后逐渐回升，在第六次取样时又达到一个小高峰。此后在下降。在调查的9个取样期间内，除食用红甜菜第3对真叶期葡糖基转移酶基因表达量明显提高外，其他几个时期相对表达量之间虽有变化但不明显。

注：1.二对真叶期 2.三对真叶期 3.四对真叶期 4.五对真叶期 5.六对真叶期 6.七对真叶期 7.七号样品(7月11日采样) 8.八号样品(8月8日采样) 9.九号样品(8月22日采样)图4 葡糖基转移酶基因在甜菜不同生长期表达差异分析

2.4.3 4,5-DOPA-双加氧酶基因的表达

由图5可见，在九个取样时期，前6个时期(七对真叶期以前)4,5-DOPA-双加氧酶基因均有不同程度的表达，在三对真叶期时表达量最高，达到15.6，而其它几个真叶期表达量虽不如三对真叶期那么高，但平均表达量也都在1左右；相比之下在取样的后3个时期几乎不表达，这说明4,5-DOPA-双加氧酶基因主要在甜菜的真叶生长期起作用，在食用甜菜的生长中后期几乎不起作用。该基因对调控红色素的合成的作用在次试验中不明确。

注：1.二对真叶期 2.三对真叶期 3.四对真叶期 4.五对真叶期 5.六对真叶期 6.七对真叶期 7.七号样品(7月11日采样) 8.八号样品(8月8日采样) 9.九号样品(8月22日采样)图5 4,5-DOPA-双加氧酶基因在甜菜不同生长期表达差异分析

3 结果与讨论

本实验对食用红甜菜9个不同生长期的酪氨酸酶基因、葡萄糖基转移酶基因和4，5-DOPA-双加氧酶基因相对表达量进行了分析，实验结果表明：基因在不同时期的相对表达量有一定的差异，但在三对真叶期是这三个基因相对表达量都显著较高的时期。酪氨酸酶基因在五对真叶期以前相对表达量较高，说明其可能在早期在甜菜叶片中起着某种作用，五对真叶期以后，其表达量有明显下降，说明其作用在减弱。葡糖基转移酶基因在甜菜生长的各个时期都发挥着作用，但其第3对真叶期作用最大。4，5-DOPA-双加氧酶基因在食用红甜菜叶片生长后期基本不表达，所以推测其对甜菜块根中红色素的累积没有什么作用。

本研究只探讨了红甜菜叶片中，红色素合成相关基因的表达情况，要想透彻了解红甜菜中红色素积累与红色素合成相关基因之间的关系，还应结合不同组织部位如叶柄、根部中的基因表达情况进行进一步的研究分析。