环状RNA研究进展

孙 畅 综述,张朝霞 审校

(新疆医科大学第一附属医院医学检验中心，新疆乌鲁木齐 830054)

人类基因组中绝大多数的序列不编码蛋白质，非编码RNA(ncRNA)占全部从真核基因组转录的RNA的95%[1]。大部分ncRNA为转录超保守区域，包括微小RNA(miRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、PIWI相互作用RNA(piRNA)、长链非编码RNA(lncRNA)和环状RNA(circRNA)，在基因调控和许多人类疾病的发展中起着越来越重要的作用[2]。作为ncRNA中的主要一员，circRNA在过去几年里引起了广泛的关注。

1 circRNA简介

circRNA是封闭的环状分子，不具有5′至3′极性的共价闭环结构或3′ poly A末端[3]。1976年，电子显微镜技术首次发现了circRNA。根据结构特点、未知功能和低丰度[4]，circRNA最初被认为是保守的分子产生的错误的拼接副产品，并没有得到太多的关注。然而，随着生物技术的进步，特别是生物信息学和高通量测序技术的发展已经鉴定了大量的circRNA。事实上，circRNA是丰富、多样和保守的分子，通常在组织表达和发育阶段具有特定的方式[5-7]。具体而言，circRNA可以起到miRNA海绵的作用，阻止mRNA翻译并通过调节剪接或转录和与RNA结合蛋白(RBP)的相互作用影响基因表达[8-12]。

2 circRNA对基因的调控作用

已经提出circRNA通过几种机制发挥作用，包括miRNA海绵、转录的修饰以及拼接修饰。

2.1circRNA作为miRNA海绵 大多数circRNA主要定位于细胞质中[5，13]，这一结果促使研究人员研究了circRNA在转录后调控中的功能，2个研究小组首次证明了circRNA可能作为miRNA海绵或竞争性内源RNA(ceRNA)来调控miRNA靶标的表达。 miRNA可以通过种子区域与mRNA的3′非翻译区域结合，并且circRNA也包含miRNA靶位点。通过与miRNA竞争，circRNA间接调节mRNA的翻译。这些研究还发现，ciRS-7 circRNA含有60多个保守的miR-7靶位点，可以作为miR-7的海绵，从而调节miR-7靶mRNA的表达。此后不久，2项研究指出大多数circRNA含有比共线性mRNA更少的miRNA结合位点[14-15]，因此，不能起到miRNA海绵的作用。然而，越来越多的研究发现，尽管缺乏大量的miRNA结合位点，许多circRNA仍可以发挥这种功能。因为越来越多的证据表明这种功能在不同物种中是保守的，所以circRNA作为miRNA海绵的作用并不是一个孤立的现象。已经证明小脑变性相关蛋白1反义转录物(CDR1as)含有多达74个miR-7的结合位点，同时可以结合RNA诱导的沉默复合物(RISC)的Argonaute(AGO)蛋白[16]。然而，含有多个miRNA结合位点的circRNA可能不具有普遍性，因为迄今为止鉴定的大多数circRNA不包含富集特定miRNA的结合位点[14]。circRNA作为miRNA海绵的证据也可以从CDR1as基因敲除小鼠的数据中看到。基因敲除动物中miR-7和miR-671的水平均较低，这些变化也与突触传递的缺陷相关[17]。这可能是由于一个具有多个结合位点的circRNA将影响大量miRNA靶标的表达。单个miRNA结合位点是否能够有效提高cicRNA与miRNA相互作用仍有待探索。此外，它们对于miRNA的储存、分类和定位也很重要，从而促进了miRNA对靶基因的调控作用[18-19]。

2.2转录调控和选择性剪接 circRNA主要分为三类：外显子环状RNA(ecircRNA)[5,16,20]环状内含子RNA(ciRNA)[20]和外显子-内含子环状RNA(EIciRNA)[11]。几乎所有分布在细胞质中的circRNA都来自于外显子[5,13];相反，circRNA和EIciRNA主要位于细胞核内[8，20]，并且很可能在转录水平中起作用。已证实EIciRNA与U1小分子相互作用，核糖核蛋白(U1snRNP)和RNA聚合酶Ⅱ(PoⅡ)通过U1snRNA结合位点结合并执行类似的顺式调节功能[11]。此外，circRNA调节其亲本基因顺式或反式转录并与其PolⅡ复合体相互作用在细胞核中激活其亲本的转录基因[20]。circRNA生物发生的反向剪接模式可以改变线性基因产物的表达。 在拼接过程中，拼接和线性拼接可以相互竞争，结果产生线性RNA或ecircRNA[10]。例如，在circMb1形成期间，circMb1与MBL前体mRNA剪接竞争，并因此负向影响规范剪接[10]。此外，在ecircRNA形成的过程中一些ecircRNA会将翻译起始位点隔开，从而导致非编码线性转录物的产生并由此减少蛋白质表达[15]。

3 circRNA与人类疾病

基于circRNA的功能，研究人员调查了circRNA在生理和病理学中的作用。现有的证据显示circRNA与自噬[21-22]、细胞凋亡[23]、细胞周期[12]和增殖相关，表明circRNA可能在疾病中起作用，并且越来越多的研究表明，circRNA通过不同的途径在不同疾病中发挥调节功能。而且，circRNA有潜力作为临床诊断指标与治疗靶点。

3.1神经系统疾病 一项研究发现，circRNA在哺乳动物脑中被检测到的丰度比在其他组织中更高[6，24]，促使许多研究人员探讨circRNA在神经系统疾病中的作用。观察到circRNA ciRS-7和miR-7的共定位，特别是在新皮质和海马神经元中大量存在[8]。 因此，ciRS-7可以执行其“海绵”功能，调节涉及帕金森病的miR-7并参与各种癌症途径。 研究人员认为，ciRS-7是神经元功能的关键因子，在神经系统疾病和脑肿瘤发展中具有重要作用[8]。

3.1.1circRNA和阿尔茨海默病(AD) AD的研究揭示了ciRS-7水平在AD患者海马CA1样品中的表达较年龄相匹配的健康对照中显着降低。 因此，预测ciRS-7缺陷可能导致选择性miR-7靶标的表达降低。 这个猜想已在随后的研究被证实[25],ciRS-7也抑制核因子-κB(NF-κB)的翻译并诱导其定位于细胞质，从而抑制UCHL1的表达，促进淀粉样前体蛋白(APP)和β-分泌酶(BACE1)降解[26]。值得注意的是，APP和BACE1在AD中产生淀粉样β蛋白而起作用[27-28]。由此推断，ciRS-7可作为治疗AD的有效靶点。

3.1.2circRNA和其他神经系统疾病 最近报道RNA结合蛋白(FUS)影响小鼠胚胎干细胞运动神经元中的circRNA表达[29]。考虑到FUS的神经退行性，包括肌萎缩侧索硬化和额颞叶痴呆[30]，先前的研究不仅阐明了FUS连接的circRNA表达的机制，而且还将circRNA功能与神经退行性过程联系起来。ZHOU等[31]通过测序分析调查神经损伤诱导的神经病理性疼痛(NP)，分析大鼠脊髓内ncRNA的差异表达，结果显示188个circRNA在无痛神经损伤后14 d内显著失调,研究人员构建了一个circRNA-miRNA-mRNA网络并验证了rno-circ-0006928和miR-184之间的关系,通过荧光素酶检测，研究结果提示circRNA在NP的发病机制中起关键作用。另一组对来自多系统萎缩(MSA)的患者的脑组织样品进行测序发现5种过表达的circRNA：IQCK、MAP4K3、EFCA11、DTNA和MCTP1。进一步的分析显示这些circRNA在MSA皮质白质组织中过表达[32]。此外，BAI等[33]发现circDLGAP4在急性缺血性卒中患者的血浆和小鼠卒中模型中下调，circDLGAP4的过表达通过对miR-143的“海绵”作用促进HECTD1表达，改善小鼠卒中模型中梗死面积和血脑屏障损伤。调查显示circDLGAP4可能成为急性缺血性损伤的一种新的治疗靶点。另一项研究表明，hsa-circRNA-103636在外周血单个核细胞中的表达可能作为重度抑郁症患者一个新的诊断和治疗生物标志物[34]。

3.2心血管疾病 几项研究表明，circRNA在心血管疾病的发生和发展中发挥重要作用。例如，WU等[35]发现在高血压患者中hsa-circ-0005870显著下调。而且，hsa-circ-0002062和hsa-circ-0022342在慢性血栓栓塞性肺动脉高血压患者血样中下调[36]。此外，一个研究小组表示，与健康对照组相比，心肌梗死患者外周血标本中circRNA MICRA的表达水平较低。低水平的MICRA患者左心室功能障碍的风险较高[37]。

3.3骨性关节炎(OA) OA是由于关节软骨的退行性变化引起的。与非OA对照组相比，在OA患者的软骨中有71个circRNA差异表达。 随着促炎症信号分子如白细胞介素1(IL-1)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达增加，circRNA-CER表达增加。circRNA-CER的抑制导致基质金属蛋白酶13(MMP13)表达降低和细胞外基质(ECM)重塑。 研究者认为，这一观察结果源自circRNA-CER对miR-136的海绵效应，且已知其靶向MMP13基因[38]。

3.4癌症

3.4.1circRNA和胃癌 circRNA是胃癌发生和发展的重要调节因子。 circRNA-100269在胃癌中下调并可抑制胃癌细胞通过靶向miR-630的新途径生长[39]。 circ-LARP4通过刺激miR-424-5p可抑制胃癌细胞的增殖和侵袭并调节LATS1表达[39]。还有报道称circPVT1、circ-0047905、circ-0138960和circ-RNA7690-15可能在胃癌肿瘤发生中起癌基因的作用[40-41]。因此，这些结果表明circRNA可能具有潜力作为胃癌诊断和预后的生物标志物。

3.4.2circRNA和人肝细胞癌(HCC) 研究表明，ZKSCAN1 mRNA和circ-ZKSCAN1密切合作抑制人类HCC细胞的生长、迁移和入侵，circ-ZKSCAN1过表达可能预示HCC的良好预后[42]。 XU等[43]报道，HCC患者CDR1as过表达，而miR-7表达水平降低，表明二者之间成负相关。CDR1as在HCC细胞中是一种致癌物质，通过吸附miR-7来促进HCC细胞的增殖和转移。

3.4.3circRNA和肺癌 ZHU等[44]研究了circ-0013958在非小细胞肺癌(NSCLC)中的功能，发现它可以吸引miR-134，并上调致癌细胞周期蛋白D1，在NSCLC的发展中具有重要作用，研究者认为circ-0013958可以用作早期的非侵入性生物标志物检测以筛查肺癌。YAO等[45]的研究表明，circ-100876在NSCLC组织中明显高于相邻非肿瘤组织，其表达水平与NSCLC的淋巴结转移和肿瘤分期相关，提示circRNA与肺癌肿瘤的发生和进展密切相关。

3.5circRNA和感染 微生物脂多糖诱导Toll受体(TLR)途径的激活，导致NF-κB的激活，参与微生物感染的防御和宿主的适应性免疫关键基因的调节。已经提出circRasGEF1B作为脂多糖反应的一部分调节ICAM-1的表达。在体外敲除该circRNA导致27%～39%的ICAM-1抑制减少；在小鼠巨噬细胞中，激活TLR4、TLR9、TLR3、TLR2和TLR1受体均调控circRasGEF1B的表达；在正常情况下通过基因修饰circRasGEF1B可以降低ICAM1的表达水平，这会促进白细胞与内皮细胞的结合及其向目标组织的迁移[46]。因此，circRasGEF1B的缺乏可能会阻止白细胞迁移到炎症部位，并干扰愈合过程，而在癌细胞中，可能还会影响细胞毒性T淋巴细胞的激活，而这些细胞毒性T淋巴细胞则将细胞溶解颗粒释放到肿瘤细胞中[46]。

已有研究报道了circRNA在病毒感染反应中的潜在作用。通过circRNA转染HeLa细胞，证实84种先天免疫相关基因的诱导表达，如RIGI和OAS1，分别上调了500倍和200倍[47]。 circRNA也可以作为与病毒线粒体RNA(mtRNA)竞争结合的竞争者。这些因素可以通过稳定核内的内含子RNA对的结合来促进环化。病毒感染导致运输这些因子从细胞核到细胞质的circRNA在细胞中的表达下降。这种作用使得circRNA可用于与病毒mRNA结合并防止病毒感染宿主细胞[48]。

ZHANG等[49]探索了肺结核(PTB)的表达谱，对3名PTB患者和3名健康个体中的circRNA使用全转录组测序。其中患者和健康人共鉴定出170个差异表达的circRNA;其中102个上调，68个下调。在表达模式中，26个circRNA上调(> 5倍变化)，这表明这些差异表达的circRNA在PTB的发病机制和进展中发挥作用，尤其是hsa-circRNA-14623、hsa-circ-09585、hsa-circ-005538、hsa-circ-09993、hsa-circ-00074和hsa-circ-13478被证实在PTB中显著失调。这些失调的circRNA可能作为新的生物标志物用于诊断PTB，这需要在大型患者队列中进一步研究。

4 circRNA的检测方法

由于生物信息学和高通量测序技术的快速发展，许多方法被用于检测circRNA。它们对于检测新的环状RNA具有不同的优势。现将circRNA的3种主要检测方法介绍如下。

4.1基因芯片技术 基因芯片技术是将大量探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。可以一次性对样品大量序列进行检测和分析，从而解决了传统核酸印迹杂交技术操作繁杂、自动化程度低、操作序列数量少、检测效率低等不足[50]。基础芯片技术具有高灵敏度和高通量的特点，检测快速、高效，此外，该方法目前已较为成熟且应用较广[51]。

4.2RNA测序技术(RNA-seq) RNA-seq利用不同种类的RNA逆转录成cDNA，通过对cDNA建库、测序，从而可以获得相应RNA的序列、结构及其表达量，可以准确地测定出circRNA 的表达水平。其采用数字化信号直接测定特定序列，具有起始RNA用量少、通量高、背景低且灵敏度高的优点。此外，RNA测序技术还可以发现新的基因，是目前深入研究基因组学的有力工具[52-53]。

4.3定量逆转录PCR法(RT-qPCR) RT-qPCR是目前常用的检测方法之一，其通过将circRNA逆转录成cDNA,然后以cDNA为模板进行扩增，实时检测扩增产物的数量，间接实现circRNA的定量分析。RT-qPCR具有灵敏度高、特异性强、简便快速、成本低等突出优点，常被用来作为基因芯片法等方法进一步的验证和确认[54]。

5 展 望

circRNA是一类ncRNA，可以通过各种机制调控基因表达，也可能有编码蛋白质的潜力，这种机制尚未被完全理解。尽管如此，circRNA正在成为潜在的重要细胞生理学的调节者以及作为疾病发生或进展的潜在生物标志物。目前关于circRNA生物学的知识尚处于早期阶段，迫切需要进一步的研究，彻底了解其功能和潜力。此外，虽然很多研究已经证明了circRNA在疾病治疗中的潜在作用，circRNA是否可以作为靶点治疗疾病仍有待确定。