不同年份湖北青砖的特征性成分分析

常睿，马梦君，罗理勇,3，蒋睿，张丽，曾亮,3*

1(西南大学 食品科学学院，重庆，400715) 2(咸宁市农业科学院，湖北 咸宁，437000)3(西南大学 茶叶研究所，重庆，400715)

青砖属黑茶类，我国三大传统边销砖茶(青砖、茯砖、康砖)之一，也称“老青砖”、“川字茶”[1]，是湖北最具代表性的茶叶，主产于咸宁市的赤壁、崇阳等地，已有一百多年生产历史。湖北青砖茶因滋味醇和，具有生津解渴、健胃助消、分解脂肪[2]、治疗糖尿病[3]、抗氧化[4]等功效，已成为边疆少数民族的生活必需品，主销内蒙古，在维护边疆稳定和民族团结方面具有积极作用。正因如此，湖北青砖在较长一段时期内都是“政策性商品、定点生产、统购统销”，产业较为封闭[5]，其不同年份的品质成分研究极少，且缺少统计分析方法的引入[6]。

黑茶耐于久藏，其品质功能与贮藏年份密切相关。黄亚辉等[7]通过对不同年份茯砖茶的感官品质和主要生化成分之间的关系进行分析，提出茶褐素/茶多酚比值可以作为鉴别茯砖茶陈化年份的生化指标；KU等[8]研究表明后发酵时间越长，普洱茶品质和滋味更好，同时普洱生茶的生物活性与贮藏时间有显著的相关性；XIE等[9]研究发现，虽然贮藏时间会导致普洱茶的生化成分和品质发生改变，但在一定的贮藏时间内，普洱茶品质相对稳定；曾亮等[10]检测分析不同年份普洱生茶水提物的107种物质后得出，当贮藏时间达到3年或8年时，普洱生茶品质将发生较为明显的变化，并筛选其特征性成分26种。目前贮藏时间对黑茶的影响研究主要集中在普洱茶[11-13]，茯砖茶[7]和六堡茶[14]，而关于贮藏时间对湖北青砖的影响研究极少。

本研究以3家公司分别提供的5个不同年份湖北青砖为研究对象，采用高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)和全自动氨基酸分析仪等检测其主要品质成分。通过主成分分析(principal component analysis，PCA)筛选特征性成分，并通过系统聚类分析(hierarchical cluster analysis，HCA)和热图(heatmap)研究年份聚类，旨在全面掌握和梳理湖北青砖的品质成分，为指导陈年湖北青砖的科学消费提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

青砖采集于湖北省赤壁市赵李桥镇的3家公司，每个样品选取5个等间隔年份，共计15个样品。同一公司样品采集前均贮藏于该公司恒温恒湿的仓库，采集后均贮藏于实验室4 ℃冰箱，保证了贮藏环境的一致性。样品具体信息见表1。

湖北青砖在所有砖茶中压制最紧，且其原料面茶和里茶不一致，因此样品在磨碎处理前需切块处理，保证取样均一。

表1 不同年份湖北青砖样品编号Table 1 The number of Hubei Qingzhuan brick tea with different storage years

1.2 试剂与仪器

1.2.1 主要试剂

福林酚、甲醇(色谱纯)、冰乙酸(色谱纯)、Na2CO3、AlCl3、水合茚三酮、氯化亚锡、Na2HPO4、KH2PO4、H3PO4、蒽酮、H2SO4、正丁醇、体积分数为95%的乙醇、乙酸乙酯、NaHCO3、草酸、没食子酸、谷氨酸、葡萄糖，重庆永捷实验仪器有限公司；咖啡碱、儿茶素单体、有机酸单体、酚酸单体、黄酮醇单体、氨基酸单体均为标准品，美国Sigma公司。

1.2.2 仪器与设备

高效液相色谱仪(LC-20)，日本岛津公司；Hypersil BDS C18柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)，美国安捷伦科技有限公司；全自动氨基酸分析仪(L-8900)，日本日立Hitachi高新技术公司；电子天平(FA1004)，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；电热恒温水浴锅(HWS-26)，上海一恒科学仪器有限公司；可见分光光度计(722-型)，上海菁华科技仪器有限公司；台式高速冷冻离心机(5810)，德国Eppendorf公司；超声波振动仪(KQ5200DE)，江苏昆山市超声仪器有限公司；微孔滤膜(0.45 μm)，上海市新亚净化器件厂；高速中药粉碎机，浙江瑞安市永历制药机械有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 茶多酚、黄酮、游离氨基酸总量、可溶性总糖、茶色素类的检测

茶多酚(福林酚法，参照GB/T 8313—2008)；黄酮(AlCl3比色法)[15]；游离氨基酸总量(茚三酮比色法，参照GB/T 8314—2013)；可溶性总糖(蒽酮比色法)[15]；茶色素类(分光光度法)[15]。

1.3.2 HPLC方法

1.3.2.1 儿茶素组分和咖啡碱的检测

流动相A：体积分数为2‰的冰乙酸水溶液，流动相B：纯甲醇；色谱柱：Hypersil BDS C18柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)；进样量：10 μL；流速：0.9 mL/min；柱温：35 ℃；检测波长：278 nm；检测时间：37 min，采用梯度洗脱程序。此方法参照马梦君等的研究方法[16]。

1.3.2.2 有机酸类物质的检测

流动相A：0.05 mol/L KH2PO4溶液(用磷酸调pH值至2.7)，流动相B：纯甲醇，流动相A∶流动相B(V∶V)= 97∶3；色谱柱：同1.3.2.1；进样量：20 μL；流速：0.6 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：210 nm；检测时间：30 min。此方法参照赵仁亮等的研究方法略有改进[17]。

1.3.2.3 酚酸类物质的检测

流动相A：体积分数为2‰的磷酸水溶液，流动相B：纯甲醇；色谱柱：同1.3.2.1；进样量：10 μL；流速：0.8 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：278 nm和324 nm；检测时间：45 min，采用梯度洗脱程序。此方法参照江和源等的研究方法略有改进[18]。

1.3.2.4 黄酮醇类物质的检测

流动相A、B和色谱柱：同1.3.2.3；进样量：10 μL；流速：0.8 mL/min；柱温：40 ℃；检测波长：360 nm；检测时间：40 min。此方法参照吴柳春等的研究方法略有改进[19]。

1.3.3 氨基酸单体的检测

参照测定游离氨基酸总量的浸提方法处理样品，按照《GB 5009.124—2016 食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》进行检测。

1.4 数据分析

2 结果与分析

2.1 不同年份湖北青砖的品质成分

2.1.1 主要品质成分

由图1-A～图1-E可知，随着贮藏时间的延长，湖北青砖的茶多酚含量呈下降趋势，其中,QZ1的下降趋势最明显，表现为贮藏1年时最高，贮藏9年时最低，降幅32.03%;QZ2表现为贮藏1年时最高，与其他贮藏时间差异显著，降幅14.12%;QZ3表现为贮藏1年时最高，贮藏9年时最低，降幅24.07%。黄酮含量呈上升趋势，QZ1、QZ2和QZ3均表现为贮藏1年时最低，贮藏9年时最高，其增幅分别为59.42%、179.69%、88.96%，且同一样品不同年份之间差异显著。游离氨基酸含量呈先降后增再降的趋势，贮藏7年时增势明显。可溶性糖和咖啡碱含量无明显规律。茶多酚具有抗癌、抗衰老、防治心血管疾病等多种生理功能，是茶汤苦涩浓强滋味的主要贡献物质，且可氧化聚合形成茶色素影响茶汤色泽[11]；黄酮类化合物(黄酮苷和黄酮醇类)由于母核常含羟基、甲氧基和烃氧基等助色团而多显黄色，同时也具有抗氧化、抗突变等功效[11]；因此随着贮藏时间的延长，茶多酚不断减少和转化，黄酮类物质不断增加和生成，湖北青砖的滋味变醇和，颜色变红黄明亮，其品质功能逐渐突显。游离氨基酸既是构成茶叶品质，尤其是茶汤鲜爽滋味的重要成分，又可与糖类发生羰氨反应生成挥发性物质，还可在特殊温湿条件下发生氧化、降解和转化，与多酚类反应生成褐色色素影响茶汤色泽[7]；随着贮藏时间的延长，其下降可能是由于氨基酸自身的氧化分解以及与其他物质聚合生成不溶性物质，其在贮藏7年时含量的增加可能与可溶性蛋白的分解有关[12]。可溶性糖(主要成分是单糖和双糖)是茶汤中的甜味成分且参与香气的形成，能有效遮蔽茶汤中茶多酚和咖啡碱的苦涩味，使茶汤滋味更加醇和；其含量变化由微生物生长繁殖利用其作为碳源、纤维素在微生物的胞外酶—纤维素酶的作用下水解成可溶性糖、美拉德反应、可溶性糖氧化发酵这几种反应达到动态平衡的结果决定[14]，因此其随着贮藏时间的延长无明显规律。咖啡碱是茶汤中苦味的重要物质基础，具有兴奋神经中枢和利尿等药理功能，其与茶黄素、蛋白质等以氢键缔合后形成的复合物具有鲜爽味[13]；在贮藏过程中，其含量一方面由于甲基转移，微生物利用其作氮源而减少，另一方面微生物的大量繁殖又促进其合成[20]，因此表现出无明显规律。

图1 不同年份湖北青砖的主要品质成分含量
Fig.1 The contents of quality components in Hubei Qingzhuan brick tea with different storage years
注：各样品不同贮藏时间不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，下同。

由图1-F～图1-H可知，随着贮藏时间的延长，湖北青砖的茶黄素含量很低且无明显规律；茶红素含量呈先降后增再降的趋势，贮藏5年或7年时增势明显；茶褐素含量呈上升趋势，QZ1、QZ2和QZ3均表现为贮藏1年时最低，贮藏9年时最高，其增幅分别为32.95%、48.38%、90.04%，且同一样品不同年份之间差异显著。茶色素类(主要包括茶黄素、茶红素和茶褐素)是茶多酚的主要水溶性氧化产物，不仅是组成茶汤黄、橙、棕的主体，也参与干茶色泽的形成。茶黄素是多酚类物质氧化形成的一类能溶于乙酸乙酯的、具有苯并卓酚酮结构的化合物的总称；茶红素既包括有儿茶素酶促氧化聚合、缩合反应的产物，也有儿茶素氧化产物与多糖、蛋白质、核酸和原花色素等产生非酶促反应的产物，是一类复杂不均的红褐色酚性化合物；茶褐素是一类水溶性非透析性高聚合的褐色物质，其主要组分是多糖、蛋白质、核酸和多酚类物质，由茶黄素和茶红素进一步氧化聚合而成，化学结构及其组成有待探明[13]。茶黄素和茶红素均是氧化聚合过程中的中间产物，因此随着贮藏时间的延长其含量无明显变化规律，而茶褐素作为最终氧化聚合产物，在黑茶中变化最明显、积累最多。

上述品质成分除咖啡碱外，其余成分均是复合物，组成复杂，不利于后续研究筛选特征性成分。因此在已较明确湖北青砖物质组分变化规律的基础上，选择儿茶素类、有机酸类、酚酸类和黄酮醇类的单体物质进行研究，为后续筛选特征性成分奠定基础。

2.1.2 各单体物质含量

各单体物质是湖北青砖品质成分的重要组成，在贮藏过程中，黑茶独有的微生物参与会使其变化更为复杂，各单体随着贮藏时间的延长具体如何变化还需进一步研究。

2.1.2.1 儿茶素和有机酸单体

儿茶素是茶多酚的主体成分，其单体主要包括6种：儿茶素(catechin，C)、表儿茶素(epicatechin，EC)、表没食子儿茶素(epigallocatechin，EGC)、表儿茶素没食子酸酯(epicatechin gallate，ECG)、没食子儿茶素没食子酸酯(gallocatechin gallate，GCG)、表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)。其中，C、EC、EGC属于非酯型儿茶素，收敛性较弱，味醇不苦涩；ECG、GCG、EGCG属于酯型儿茶素，具有强烈收敛性，苦涩味较重；它们均是构成茶汤滋味的重要物质[14]。由图2可知，随着贮藏时间的延长，湖北青砖的C、EGC和GCG含量无明显规律；EC含量均呈下降趋势，其中QZ1在贮藏5～9年时未检测出；ECG含量除QZ2呈下降趋势外，其余样品无明显规律；EGCG含量呈下降趋势，QZ1、QZ2和QZ3均表现为贮藏1年时最高，贮藏9年时最低。湖北青砖茶中EGCG和EC的含量随着贮藏时间延长而呈下降趋势，这可能与儿茶素的自动氧化、非酶促氧化(与蛋白质、有机酸等物质的结合)、微生物酶促氧化、酯型儿茶素的水解等有关[21]。

黑茶中的有机酸含量与其发酵程度呈高度正相关，严重制约渥堆发酵的微生物菌群，对酸碱平衡起重要的调节作用，同时有机酸作为糖类分解的中间产物，对香气形成也具有重要作用[13,22]。由图2可知，随着贮藏时间的延长，湖北青砖的奎尼酸含量无明显规律；除QZ2外，苹果酸含量呈下降趋势；QZ3的柠檬酸含量呈下降趋势，且不同贮藏时间之间差异显著，其余样品的柠檬酸含量无明显规律；琥珀酸含量呈增加趋势，各样品均表现为贮藏1年时最低，贮藏9年时最高。另外，湖北青砖的儿茶素组分中，除EGCG和EC含量较高外，其余单体都较有机酸各单体含量低，此结果与唐飞等[6]的研究结果一致；屠幼英等[23]认为，经微生物发酵后的紧压砖茶的有机酸含量明显高于不发酵茶，且有机酸可能与儿茶素进行反应形成儿茶素酯，造成儿茶素组分的下降。

图2 不同贮藏时间湖北青砖QZ1(A)、QZ2(B)、
QZ3(C)的儿茶素和有机酸单体含量
Fig.2 The contents of catechin and organic acids in Hubei
Qingzhuan brick tea QZ1(A), QZ2(B), and QZ3(C) with
different storage years

2.1.2.2 酚酸和黄酮醇单体

由图3可知，湖北青砖的酚酸类物质中，除没食子酸和水杨酸的含量较高之外，其余5种酚酸的含量都很低。随着贮藏时间的延长，湖北青砖的没食子酸的含量呈增加趋势，且各贮藏时间之间差异显著；原儿茶酸、新绿原酸、绿原酸、咖啡酸和对羟基肉桂酸含量相对较低，且无明显规律；水杨酸含量呈增加趋势，各样品均表现为贮藏1年时最低，贮藏9年时最高。没食子酸是黑茶中最重要的酚酸，其随贮藏时间的延长而增加与微生物分解、EGCG等酯型儿茶素的氧化分解等有关[24]。

图3 不同贮藏时间湖北青砖QZ1(A)、QZ2(B)、
QZ3(C)的酚酸和黄酮醇单体含量
Fig.3 The contents of phenolic acids and flavonols in
Hubei Qingzhuan brick tea QZ1(A), QZ2(B)， and
QZ3(C) with different storage years

由图3可知，湖北青砖的黄酮醇类物质中，槲皮素含量最高，其次是山奈酚，含量最低的是杨梅素。随着贮藏时间的延长，湖北青砖的杨梅素、槲皮素和山奈酚的含量均呈增加趋势，均表现为贮藏1年时最低，贮藏9年时最高。茶叶中的黄酮醇类化合物主要由山奈酚、槲皮素、杨梅素及其与糖类形成的黄酮苷类组成，其水溶液呈绿黄色，其转化和增加有利于湖北青砖茶汤颜色形成[25]。

2.1.2.3 氨基酸单体

由图4可知，湖北青砖的游离氨基酸单体中，茶氨酸含量最高，占17种氨基酸总量的40%以上；含量较高的氨基酸有天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸和精氨酸。仅在部分贮藏时间检测到的氨基酸有丝氨酸、异亮氨酸和精氨酸。脯氨酸在所有青砖样品中均未检测出。

图4 不同贮藏时间湖北青砖QZ1(A)、QZ2(B)、
QZ3(C)的氨基酸单体含量
Fig.4 The contents of free amino acids in Hubei Qing-
zhuan brick tea QZ1(A), QZ2(B)， and QZ3(C) with
different storage years

随着贮藏时间的延长，茶氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸呈整体下降趋势。茶氨酸属酰胺类化合物，具有类似味精的鲜爽味，味觉阈值低且极易溶于水，故其鲜甜味极易在茶汤中呈现，从而能消减茶多酚和咖啡碱引起的苦涩味[25]；其随着贮藏时间延长而下降是湿热作用和微生物综合作用的结果[26]。

2.2 PCA筛选特征性成分

PCA分析是将上述检测得到的45种成分进行数据转换和降维，并对降维后的特征向量进行线性分类，从而在分析图上只显示最重要的2个综合指标，形成二维散点图(图5)。

图5 不同贮藏时间湖北青砖的第1、第2主成分
得分散点图
Fig.5 The scatter plot of the first and second principal
component scores of Hubei Qingzhuan brick tea with
different storage years

由表2可知，前7个主成分的累积贡献率达86.61%，表明前7个主成分可以基本反映全部成分变量的信息。其中PC1可解释全部成分变量信息的34.75%；PC2可解释19.60%；PC3可解释9.30%；PC4可解释7.31%；PC5可解释6.37%；PC6可解释5.13%；PC7可解释4.15%。通过PCA进行降维，将原来的45个成分变量转化为7个新的变量指标，降低了分析的复杂性，且基本保持了原有成分变量的信息。由主成分旋转载荷矩阵表可知，亮氨酸、茶氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、黄酮、杨梅素、水杨酸、茶褐素对第1主成分贡献率较大，绿原酸、原儿茶酸、咖啡酸、对羟基肉桂酸对第2主成分贡献率较大，茶红素对第3主成分贡献率较大，咖啡碱对第4主成分贡献率较大，GCG对第5主成分贡献率较大，茶黄素对第6主成分贡献率较大，茶多酚对第7主成分贡献率较大。由图5可知，贮藏9年和贮藏7年的青砖分布较集中，贮藏1～ 5年青砖分布较散乱。贮藏7年青砖与其他样品距离较近，贮藏9年青砖与其他样品距离较远。这表明随着贮藏时间的延长，湖北青砖的品质转化始于贮藏7年，贮藏9年时差异明显。

表2 主成分的特征值和方差贡献率Table 2 Eigenvalues and variance contribution ratesof principal components of Hubei Qingzhuan brick teadifferent storage years

综上分析可知，不同贮藏时间湖北青砖中贡献较大且有明显变化规律的物质有10种，可作为不同贮藏时间湖北青砖的特征性成分。这10种物质分别为氨基酸(亮氨酸、茶氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸)、黄酮、黄酮醇类(杨梅素)、酚酸类(水杨酸)、茶褐素、茶多酚，它们是影响不同贮藏时间湖北青砖茶营养品质的关键成分，可基本反映其品质特征。

2.3 HCA和heatmap研究年份聚类

以欧式距离的平方为不同类别数据点间距离(相似度)的计算准则，以组间平均连接法为组群的合并准则，对3个样品各5个年份的茶样进行HCA，结果见图6A。热图(heatmap)是对实验数据分布情况进行分析的直观可视化方法，可以用来进行实验数据的质量控制和差异数据的具像化展示[27],见图6-B。结合图6-A和图6-B可知，在20欧氏距离处可将15个青砖样品聚为2类，QZ1(3年)、QZ1(5年)、QZ1(7年)、QZ2(7年)、QZ1(9年)、QZ2(9年)和QZ3(9年)聚成第1类，这一类青砖的茶多酚含量较低，黄酮和茶褐素含量较高。第2类在15欧氏距离处可分为2个亚类，其中第1亚类为QZ2(3年)、QZ3(5年)，这一类青砖的咖啡碱和茶红素含量较低；第2亚类为QZ1(1年)、QZ2(1年)、QZ3(1年)、QZ2(5年)、QZ3(3年)、QZ3(7年)，这一类青砖的茶多酚和茶氨酸含量较高，黄酮和茶褐素含量较低。在10欧氏距离处，第1类可分为2个亚类，其中第1亚类为QZ1(3年～7年)和QZ2(7年)，第二亚类为QZ1(9年)、QZ2(9年)和QZ3(9年)。在3欧氏距离处，QZ1(7年)和QZ2(7年)聚为一小类。

从聚类结果来看，由于实验材料来源于赵李桥不同厂家，其原料及制作工艺的细微差异使贮藏1～ 5年的湖北青砖茶的聚类呈交叉分布，但贮藏9年和7年的湖北青砖品质成分变化较显著，较容易聚为一类，与其他样品区分开来，这表明青砖转化始于贮藏7年时，到贮藏9年时差异明显，此结果与PCA结果一致。从heatmap的颜色变化来看，贮藏7年和9年青砖的共同特征为茶多酚含量较低，黄酮和茶褐素含量较高，表明影响湖北青砖年份聚类的关键品质成分为茶多酚、茶褐素和黄酮。

图6 不同贮藏时间湖北青砖的聚类树状图和
热图
Fig.6 The cluster dendrogram and heatmap of Hubei
Qingzhuan brick tea with different storage years
注：热图数据转化采用z分数标准化(z-score标准化)，每个
小方格表示其物质含量相对丰度，含量越大颜色越深，空白方格
表示该物质未检出.

3 结论

本研究以不同年份的湖北青砖为研究对象，通过测定其主要品质成分，并结合多元统计分析方法和heatmap研究后得出：(1)随贮藏时间的延长，黄酮及黄酮醇类(杨梅素、槲皮素、山奈酚)、茶褐素、没食子酸、水杨酸、琥珀酸的含量呈增加趋势，而茶多酚、儿茶素类(EC和EGCG)、游离氨基酸(茶氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸和组氨酸)的含量呈下降趋势；(2)PCA筛选出特征性成分10种，分别是游离氨基酸(亮氨酸、茶氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸)、黄酮、黄酮醇类(杨梅素)、酚酸类(水杨酸)、茶褐素、茶多酚；(3)HCA和heatmap综合反映了湖北青砖自然贮藏过程中的变化，因自然陈化变化缓慢，在一定贮藏时间内湖北青砖茶品质成分差异较小，转化始于贮藏7年时，贮藏9年时差异明显，此结果与PCA结果一致，且影响湖北青砖年份聚类的关键品质成分为茶多酚、茶褐素和黄酮。

本研究中，同一企业不同年份青砖样品均采用同一标准的老青茶为原料，加工后利用公司成熟的拼配技术和严格的贮藏条件保证了不同年份青砖茶品质的稳定性，从而较好地规避了因原料不同而导致的生化成分差异。贮藏时间是影响青砖茶后发酵过程的最关键因素之一，适当的贮藏时间可使青砖茶滋味更为醇和，香气更加趋于饱满优雅，其品质风格突显，价值也较新茶提升；除此之外，生产企业的原料选择、拼配技术和贮藏条件也是贮藏时间相关研究的基础，需重点把控。以本研究为基础，后续研究将扩大青砖茶样品种类和贮存年限，科学解读贮藏时间对青砖茶品质的影响，促进青砖茶产业健康发展。