检测小鼠血清3DAg-SERS基底制备及表征

(中南民族大学 化学与材料科学学院,湖北 武汉 430074)

表面增强拉曼光谱拉曼技术(Surface-enhanced Raman Spectroscopy,SERS)[1]是通过化学或物理吸附方式将被检测的目标物分子拉到基底表面,通过改变其极化率[2]或电磁场使被检测物质的拉曼光谱得到明显放大[3].对氨基苯硫酚作为农药、医药、染料的中间体,检测其残留量有重要意义。现有检测方法如电化学检测法[4],此法检测需进行样品前处理、耗时长,敏度低。SERS检测技术优势在于样品无需前处理可进行实时检测且检出限低至ng/L,应用在血清检测重疾早期筛查、检测、治疗[5],提供新方法并有望提高检测的灵敏度和效率。常规基底制作方法要用到光刻机、离子溅射器等价格昂贵的设备[6],不具有普适应,本实验通过电化学阳极氧化-原位生长的方式制备出表面具有高密度hot-spots的SERS活性基底。实验采用针灸针为固体基板,将其应用到小鼠血清样品的检测,采样创口小可实时检测最低可检测出稀释10-5倍血清样品,以期可将此SERS基底运用到临床取样检测的实际应用中。

1 实验部分

1.1 试剂和仪器

柠檬酸、氟化氨、硝酸钾、硝酸银、对氨基苯硫酚(4-ATP)乙二醇、乙醇(阿拉丁试剂公司)试剂均为分析纯。单输出直流电源(KPS-6005D深圳市兆信仪器有限公司),热场发射扫描电子显微镜(日本电子株式会社JSM-7800F型),拉曼光谱仪(美国赛默飞公司DXR2XI型)。

1.2 基底制备与表征

准备3支直径0.3mm长度40mm一次性无菌针灸针，依次放入丙酮、甲醇、去离子水(电阻率>18.25MΩ)中超声清洗,氮气吹干。精密称取0.12gNH4F,0.6g柠檬酸,溶解于25mL体积比9∶1的乙二醇去离子水溶液记为电解液A.直径0.3mm铂丝为对电极,针灸针为工作电极,直流电源施加恒压50V。50min时取出去离子水清洗,氮气吹干放入电解液B(3mmol/LAgNO3、3mmol/LKNO3、0.6mgFeCl3)中,负极为氧化后的针灸针正极为铂丝电极电压调至0.79V,电镀时间20min、30min、40min、60min时取出,SEM进行表征、观察形貌。SERS基底信号准确性:编号为1、2、3,SERS基底浸入5mL 10-6mol/L 4-ATP溶液自组装30min,各随机选取一点测试,实验条件：He-Ne气体激光器,激发光633nm,能量为1mw,激光照射3s,除去表面污染物,曝光时间0.05sec扫描次数为1次。SERS基底信号重现性:将1号取出,随机选取5点,每点扫描3次并在1037～1104cm-1峰面积积分。

1.3 4-ATP检测及小鼠血清检测

精密称取4-ATP 0.0125g,乙醇溶液配置成10-2mol/L储存液,梯度稀释.准备小鼠血清样品记为C0,将其用去离子水(电阻率>18.25MΩ)依次释成一系列浓度(C0×10-1,C0×10-2,C0×10-3,C0×10-4,C0×10-5)小鼠血清溶液,将制备完成的SERS基底与稀释液自组装30min。数据采集条件：激发光633nm,激光能量3mW,照射30s,曝光时间0.05sec扫描次数1次。

2 结果与讨论

2.1 制备条件

不锈钢针灸针氧化后,针体表面会形成5～20μm的氧化膜,此氧化膜表面的介孔可作为银离子还原的生长位点[6]。在Ag+还原过程中，电解液中添加的少量Fe3+作为阴极去极化剂可避免析氢的极化作用。随着时间的增加，阳极氧化过程不断在加深。直至40min时可以明显观察到针灸针表面均匀的铺满一层介孔，这些介孔为后续Ag+的还原以及3D-AgNPS提供了良好的生长条件。故50min为阳极氧化的最佳条件。

为确定还原条件,将还原时间定位1h，因为硝酸银溶液的浓度影响Ag(Ⅰ)还原的速度和量有关，改变硝酸银溶液的浓度，并确定最佳生长条件。浓度为3mmol/L银团簇的密度大且均匀，浓度过高会导致还原速度过快在基底上易形成块状结构，浓度过低会导致还原时间过长。故还原过程中选择电解液浓度为3mmol/L的硝酸银溶液为佳。

为确定最佳还原时间，硝酸银浓度固定为3mmol/L，电镀时间为变量0.5、1、1.5和2h。当还原时间为0.5h有少许银纳米颗粒生成，但密度较低。1h时大量的Ag+被还原成银金属且密度较高。电镀时间过长Ag枝状结构明显增多直至成块状颗粒。图1为阳极氧化时间50min还原时间(a)20min,(b)30min,(c)40min,(d)60min的SEM图像。图1(a),(b)有少许银纳米颗粒生成,密度较低。(c)还原时间40min,大量Ag+被还原成银金属,密度较高。电镀时间过长Ag枝状结构成块状颗粒(d),此结构非纳米数量级,会导致金属局域表面等离子共振[7]转为表面等离子共振[8]使SERS基底活性降低,拉曼信号增强明显下降，故采用1h为银离子还原的最佳时间。

图1 AgNO3浓度3mmol/L,氧化50min,还原(a)20min,(b)30min,(c)40min,(d)60min

2.2 信号准确性及重现性

4-ATP SERS图谱中拉曼位移与文献比对可知,1574 cm-1νC-C,1441cm-1、1391cm-1、1311cm-1的拉曼位移可分别归于b2类型,νC-C+νC-H[8]、νC-C+δC-H[8]、νC-C+δC-H[8]的振动。1078cm-1由C-S键振动产生[9]受各种干扰较小,以1037～11104cm-1范围峰面积为标准用以检验重现性。同一实验条件,不同位置重复检测,得样品信号峰面积的相对标准偏差为2.74%,表明基底信号重现性良好。

2.3 4-ATP及小鼠血清检测

图2 不同浓度4-ATP SERS光谱图

图2显示,SERS信号强度随样品浓度的降低而减弱,可证明SERS信号的强度与样品本身的量有关。以1037～1104cm-1峰面积和样品浓度数据进行分析得：4-ATP浓度在10-12～10-4mol/L围内的线性方程为Y=5.124X-12.36,相关系数r=0.989线性关系良好,检出限可低至10-12mol/L。

图3 小鼠血清浓度为C0,C0×10-1,C0×10-2, C0×10-3,C0×10-4,C0×10-5SERS光谱图

应用SERS手段检测血清样品时要特别注意：若激发样品的能量过高则会引起荧光效应导致检测信号过低或信号被荧光信号所覆盖而检测不到信号[10]。小鼠血清检测过程中,未稀释血清溶液为参考标准。逐级稀释5份样品与未稀释样品作为检测对象,研究基底对于低浓度的小鼠血清溶液的检测灵敏度。图3所示,随小鼠血清浓度降低,基底检测样品SERS信号减弱。如570cm-1,980cm-1,1000cm-1及1280cm-1随着样品稀释倍数增加SERS信号强度明显降低1600cm-1和1700cm-1波数位移随着血清稀释倍数增加逐渐归于一个拉曼位移,当稀释浓度为C0×10-5时1600cm-1和1700cm-1不再明显。综上所述,此基底可应用于检测小鼠血清样品,最低可检测到原样品稀释10-5倍。

3 结论

本文采用电化学腐蚀-生长方法制备了不锈钢针灸针

SERS活性基底。基底表面树枝状3DAgNPS结构为致密的Hotspots,提升了基底增信号的性能.此方法制备的SERS基底采集信号快速、准确且灵敏度高,可满足直接检测小鼠血清的要求且使用设备简单、花费低、为制作微创SERS活性基底并应用于临床取样及检测提供了新思路。