高压均质优化提取芦笋多糖及抗氧化能力的研究

付建鑫，张桂香，邵家威，张炳文

（济南大学食品科学与营养系，山东济南 250000）

芦笋学名芦荀，为百合科的天门冬属植物，通常称为龙须菜等。芦笋富含多种游离的必需氨基酸、微量元素硒和多肽、VC 等多种营养成分[1-3]，同时含有大量的黄酮[4-5]、多糖类[6-7]生物活性成分。芦笋多糖由多个单糖通过糖苷键连接而成，具有降低高血脂、调节免疫及预防癌症等[8-9]功效。

目前，对于果蔬及植物中多糖的提取方法主要有超声和微波辅助提取法、有机溶剂萃取法、水提醇沉法及酶解提取法等。传统加工方法已经不能满足食品工业化生产中的需求，利用高压均质机处理方法，通过增大压力破碎细胞壁，增加胞内和胞间多糖溶出来达到高效的目的。试验从芦笋废弃老茎（不可食部分） 原料中提取多糖，并通过高压均质机械处理法，以正交设计试验优化其工艺条件并测定了抗氧化性，为提高芦笋的综合利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

绿芦笋，采自山东济宁市鱼台芦笋种植基地。

无水乙醇、浓硫酸、浓盐酸、三氯甲烷、正丁醇、氢氧化钠、无水葡萄糖、苯酚、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸亚铁、邻菲罗啉、1,1 -二苯基-2 - 三硝基苯肼、邻苯三酚、三羟基氨基甲烷、Cu2SO4、茚三酮、酒石酸钾钠、硫酸钠、α - 萘酚、醋酸铅、冰醋酸等均为分析纯，天津市恒兴化学试剂制造有限公司提供。

WZJ-6J 型振动式药物超微粉碎机，济南倍力粉技术工程有限公司产品；XO-SM200 型超声波微波组合反应系统，南京先欧仪器制造有限公司产品；UV-5500PC 型紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司产品；TGL-16M 型冷冻高速台式离心机，湘仪离心机仪器有限公司产品；旋转蒸发器、电子分析天平、电热鼓风干燥箱及其他玻璃仪器。

1.2 试验方法

1.2.1 原料制备及处理

将市售绿芦笋老茎剔除泥沙，切丁于50 ℃下烘干。将绿芦笋老茎干基用无水乙醇浸提数次，直至无色；将无水乙醇蒸干，用石油醚浸提24 h，脱去脂肪；浸提后的芦笋老茎用蒸馏水冲洗，烘干备用。

1.2.2 不同条件机械处理提取多糖

选取经过1.2.1 处理后的每1 kg（均以干基计，下同） 恒质量绿芦笋根部原料分别进行振动式超微粉碎处理、超速分散处理、高压均质处理，比较3 种机械处理的多糖提取效果，筛选最佳机械处理方法。

振动式超微粉碎机处理，记为G1：振动式超微粉碎机处理绿芦笋根部1 kg，振动时间20 min（反振2 min）、次数1 次，取料提取，测定多糖含量。

高速分散机处理，记为G2：高速分散机处理绿芦笋根部1 kg，在料液比为1∶20，转速10 000 r/min条件下高速分散2 min 后测定多糖含量。

高压均质机处理，记为G3：高压均质机处理绿芦笋根部1 kg，在料液比为1∶20，压力60 MPa，均质次数1 次条件下进行高压均质处理后测定多糖含量。

1.2.3 提取成分定性方法[10]

Feling 反应：水提粗多糖液经酸水解后，加入新制备的碱性酒石酸铜上层清液；

Molish 反应：1 mL 水提粗多糖液加入3 滴α -萘酚振荡摇匀，加入0.5 mL 浓硫酸；

油斑试验：将1 mL 乙醚提取粗多糖液置于表面皿，挥干后观察是否油渍残留；

丙烯醛试验：将2 mL 乙醚粗多糖液置于表面皿，挥干后加4 粒Na2SO4加热；

醋酸铅沉淀反应：2 mL 水提粗多糖液加入饱和醋酸铅溶液直至无沉淀后，离心取上清液加入碱式醋酸铅；

酸沉反应：1 mL 水提粗多糖溶液加入1%H2SO4；

双缩脲反应：1 mL 水提粗多糖溶液加入3 滴10% NaOH，边摇匀加入4 滴0.5% H2SO4；

茚三酮反应：1 mL 水提粗多糖溶液加入2 滴0.2%茚三酮，摇匀后沸水浴3 min，冷却。

1.2.4 Sevege 法除蛋白[11]

配制比例为4∶1 的氯仿-正丁醇（Sevege） 溶液，与芦笋多糖粗提液以1∶3 的比例混合振荡，静置10 min，反复多次至中间层无蛋白。取脱蛋白后的上清液在4 ℃条件下以转速10 000 r/min 离心10 min，上层清液即为粗多糖溶液。

1.2.5 多糖沉淀[11]

粗多糖溶液加入过量无水乙醇，于4 ℃下醇沉18 h。在4 ℃条件下，以转速11 000 r/min 离心20 min，沉淀即为芦笋粗多糖。

1.2.6 多糖含量的测定

（1） 最大吸收波长的确定。同时移取1 mL H2O，1 mL 6%苯酚，5 mL H2SO4和0.1 mg/mL 的葡萄糖标准溶液1 mL，1 mL 6%苯酚，5 mL H2SO4分别作为空白对照和试验组，放置5 min 后沸水浴15 min，流水冲洗冷却至常温后用紫外吸收分光光度计在波长300～800 nm 处进行寻峰。

（2） 标准曲线的绘制。准确称量干燥至恒质量的葡萄糖0.100 0 g 定容至1 000 mL，即为100 μg/mL的葡萄糖标准液。按表1 配制各所需溶液，摇匀静置5 min 后沸水浴15 min，流水冲洗冷却至室温，在1.2.6（1） 方法中的吸收峰波长处测定吸光度（A），绘制葡萄糖标准曲线。

葡萄糖标准曲线见表1。

表1 葡萄糖标准曲线/mL

（3） 多糖得率的计算。

式中：Y——多糖得率，%；

A0——粗多糖质量，mg；

AI——芦笋原料质量，mg。

1.2.7 单因素试验设计

在控制单一变量因素条件下，分别考查料液比、均质次数、均质压力3 个因素对多糖提取得率的影响。

1.2.8 正交试验因素与水平

在单因素试验基础上，选取料液比、均质次数、均质压力3 个因素，选用L9（34）正交试验，以多糖得率为考查指标，优化高压均质法提取芦笋根部多糖工艺。

正交试验因素与水平设计见表2。

表2 正交试验因素与水平设计

1.2.9 抗氧化试验[12]

（1） DPPH 自由基清除试验。分别配置质量浓度为0.25，0.50，1.00，2.25，4.50，9.00，18.00 mg/mL的7 个梯度的芦笋多糖溶液，分别移取0.4 mL，然后加入0.065 mmol/L 的DPPH 自由基乙醇溶液7.6 mL于具塞试管中，室温反应30 min，于波长517 nm 处测定吸光度，试剂溶液为空白。

式中：X——DPPH 自由基清除率，%；

At——多糖溶液吸光度；

A0——试剂空白。

（2） 羟自由基清除试验。参考段雅庆[12]的方法加以改进，利用Fenton 法[15]反应原理，配制1.2.9（1）系列浓度的多糖溶液。按照表3 依次加入摇匀，置于37 ℃水浴锅中反应1 h 后取出，冷却至室温用PBS 溶液作参比，于波长510 nm 处测定吸光度。

羟自由基清除反应步骤见表3。

表3 羟自由基清除反应步骤/mL

式中：Y——羟自由基清除率，%；

A2——多糖溶液吸光度；

A0——试剂空白；

A1——过氧化氢试剂空白。

2 结果与分析

2.1 3 种机械提取法多糖得率结果

不同方法提取多糖得率见图1。

由图1 可知，在提取原料为1 kg 干质量时，高速分散处理提取多糖得率最低，仅达到1.90%；高压均质法提取多糖得率最高，在料液比为1∶20，压力60 MPa，均质次数1 次条件下，提取率达3.76%。因此，通过高压均质方法提取多糖效果最好。

图1 不同方法提取多糖得率

2.2 芦笋提取成分定性检验结果

芦笋提取成分定性检验见表4。

表4 芦笋提取成分定性检验

由表4 可知，绿芦笋根部提取液中，含有糖、多糖或糖苷，少量氨基酸、蛋白质及多肽，不含有黄酮及油脂等成分。原料干粉经过乙醇和乙醚浸提后，除去了醇溶性色素、多酚、黄酮及油脂等成分，可测定多糖抗氧化性。

2.3 最大吸收波长

试验结果显示，于波长490 nm 处样品溶液的吸光度达到最大，A=0.781。最终，选择测定芦笋多糖含量时的最佳吸收波长为496 nm。

2.4 葡萄糖标准曲线

葡萄糖标准曲线见图2。

图2 葡萄糖标准曲线

由图2 可知，以吸光度（A） 为纵坐标、葡萄糖质量浓度（C，μg/mL） 为横坐标作回归分析，得回归方程：A=0.048 1C+0.006 2，R2=0.999 1。

2.5 高压均质处理法的单因素结果

2.5.1 料液比对多糖得率的影响

料液比对多糖得率影响见图3。

图3 料液比对多糖得率影响

由图3 分析可知，随着料液比增加，多糖提取得率随之升高，料液比为1∶30 时多糖提取率达到最高，此时多糖得率为3.84 %；当料液比继续升高至1∶35 时，多糖得率反而降低。可能的原因是，料液比的增加不利于溶剂的充分提取，使提取效率下降。因此，试验选择的最佳料液比为1∶30。

2.5.2 均质次数对多糖得率的影响

均质次数对多糖得率影响见图4。

图4 均质次数对多糖得率影响

由图4 分析可知，均质次数对多糖得率的影响较小，分别均质1，2，3 次的多糖得率分别为3.89%，4.14%，4.21%。即使均质3 次较2 次的多糖得率提高了0.02%，但考虑到实际生产中的经济成本和提取效率，故确定高压均质次数为2 次。

2.5.3 均质压力对多糖得率的影响

均质压力对多糖得率影响见图5。

图5 均质压力对多糖得率影响

由图5 分析可知，随着均质压力的增大，多糖得率也提高。当均质压力达到80 MPa 时，多糖得率达到3.84%，此时多糖得率增加幅度最大。其原因是随着压力的增加，部分细胞破壁，处于胞内和胞质中的多糖溶出细胞，进而增加了多糖的得率[13]。当均质压力继续增加到100 MPa 时，多糖得率4.07%，此时多糖提取率达到最大，但相比80 MPa 的多糖得率仅增加0.23%。该均质机最大均质压力120 MPa，实际生产中考虑到耗能及升压的时间成本，防止压力过高爆缸，因此选择80 MPa 为最佳均质压力。

2.6 正交试验结果及极差分析

正交试验结果见表5。

表5 正交试验结果

由表5 可知，影响高压均质处理芦笋多糖得率的3 个因素的主次顺序为均质压力（A） ＞料液比（B） ＞均质次数（C），最优组合为A3B3C3，即均质压力100 MPa，料液比1∶35，均质3 次为高压均质处理芦笋的最佳试验条件。

平行验证试验结果见表6。

表6 平行验证试验结果

在均质压力100 MPa，料液比1∶35，均质3 次工艺条件下进行3 次平行试验，芦笋粗多糖的平均得率为4.16%。

2.7 抗氧化能力结果分析

芦笋多糖对DPPH 自由基和·OH 的清除能力见图6。

由图6 可知，随着多糖质量浓度的增加，DPPH自由基的清除率也随之增大，清除能力较羟自由基清除率更高。当多糖质量浓度分别达到2.25 mg/mL和1.0 mg/mL 时，DPPH 自由基和羟自由基的清除增长率明显减小；当多糖质量浓度达到18 mg/mL 时，二者清除能力达到最高，分别为74.2%和68.4%。由此可见，芦笋多糖对DPPH 自由基、羟自由基的清除能力呈现一定的量效关系。

图6 芦笋多糖对DPPH 自由基和·OH 的清除能力

3 结论

比较了振荡式超微粉碎、高速分散及高压均质3 种不同处理方式的芦笋多糖得率。采用高压均质处理的方式，在单因素的基础上采用正交试验方法优化提取芦笋多糖并测定了抗氧化性。结果表明，高压均质处理相比于振动式超微粉碎和高速分散处理具有较好的多糖提取效果。结合试验条件和实际操作，其正交优化的提取工艺参数为均质压力100 MPa，料液比1∶35，均质3 次，多糖得率平均为4.16%，具有较好的抗氧化能力。