食品及环境样品中双酚类物质的前处理及检测方法研究进展

张雨佳, 凌 云, 张 元, 张 峰*

(1.中国检验检疫科学研究院食品安全研究所, 北京 100176; 2.国家癌症中心, 国家肿瘤临床医学研究中心, 中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院药剂科, 北京 100021)

双酚A(bisphenol A, BPA)是聚碳酸酯、环氧树脂等多种高分子材料的重要组成成分,添加BPA作为功能单体的聚碳酸酯材料具有无色透明、轻巧耐用和防冲击等特性[1],因而广泛用于生产婴儿奶瓶、玩具和医疗设备,而环氧树脂则常被用作食品罐头、婴儿奶粉罐、饮料纸盒的衬里[2]。在工业合成过程中,不完全的聚合反应可能导致BPA单体残留,进而迁移到食品中[3]。BPA的广泛生产使用以及代谢和迁移特性导致生态环境中的土壤、水、沉积物等介质均受到不同程度的BPA污染。研究表明,BPA作为一种环境内分泌干扰物,具有抗雄激素和类雌激素效应[4],可影响体内正常新陈代谢,引发某些生殖性疾病和代谢性疾病的产生[2,5]。BPA能够引起细胞DNA损伤和染色体异常,对遗传物质、免疫系统等均具有明显的毒性[6],长期摄入可引发人体生殖系统、免疫系统受损,对婴幼儿危害更大[7]。

考虑到BPA对环境的污染和对人体较大的危害性,各个国家和地区相应出台一系列法规,严格控制BPA的添加和使用。欧盟成员国规定自2011年3月1日起禁止使用含BPA的塑料生产婴儿奶瓶,2011年6月1日起禁止进口此类塑料婴儿奶瓶。美国、加拿大、澳大利亚、新西兰等国家和地区均已立法,禁止和限制BPA的添加和使用[8]。生产商寻找双酚类似物替代BPA,然而研究表明,其他双酚类物质如双酚B、双酚C等同样存在潜在危害[9,10]。基于上述因素,开发食品和环境样品中双酚类物质的精准检测方法十分必要。然而食品和环境样品基质组成较为复杂,在含量较低的情况下直接利用常规仪器检测方法很难检出,常需结合多种提取、富集的前处理技术和高灵敏度的仪器分析方法进行检测。

目前关于双酚类化合物的样品前处理技术主要有液液萃取(liquid-liquid extraction, LLE)、分散液液微萃取(dispersive liquid-liquid microextraction, DLLME)、微波辅助萃取(microwave-assisted extraction, MAE)、固相萃取(solid phase extraction, SPE)、基质分散固相萃取(matrix solid-phase dispersion, MSPD)、QuEChERS等,常用检测方法有液相色谱-紫外分析法(liquid chromatography-ultraviolet, LC-UV)、液相色谱-串联质谱法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)、气相色谱法(gas chromatography, GC)、气相色谱-质谱法(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)、毛细管电泳法(capillary electrophoresis, CE)、酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assays, ELISA)、生物传感器法等。本文介绍食品及环境样品中双酚类物质的前处理和仪器分析方法研究进展,为后续开发新型双酚类物质提取、净化和检测方法,实现精准、快速、高效测定提供参考。

1 样品前处理技术

1.1 液液萃取

LLE操作简单、适用性广,是从固体和液体样品中分离双酚广泛应用的技术,常用萃取溶剂为乙酸乙酯、氯仿或二氯甲烷[11]。为了保证双酚类物质的完全提取,一般需要重复进行,溶剂总消耗量(包括重复提取和洗涤)在40 mL至300 mL之间,萃取时间从10 min到120 min不等。萃取溶剂的选择性有限,在仪器分析之前需要先净化,以免降低仪器分析性能。对于食品中双酚浓度较低的,需要先蒸发溶剂浓缩后再检测。钱镭等[12]建立了食用油中壬基酚和BPA的LC-MS测定方法,样品经乙酸乙酯-环己烷溶解,凝胶色谱(GPC)净化后进行检测。壬基酚和BPA的回收率在85.1%～112.5%之间,检出限均为1 μg/kg。曲双双等[13]在测定婴幼儿配方奶粉中的壬基酚和BPA时,用乙酸乙酯-环己烷作为萃取溶剂除去脂类杂质,回收率为81.3%～109.8%,检出限为1 μg/kg。LLE根据目标物在萃取剂两相中的溶解程度差异实现分离,无需复杂前处理设备,但有机溶剂使用量较大,易造成环境污染。

1.2 分散液液微萃取

DLLME能够实现样品的快速萃取富集。萃取剂在分散剂作用下于样品溶液中形成分散的细小液滴,增大了萃取剂和分析物的接触面积,使分析物在样品溶液及萃取剂之间快速达到分配平衡[14]。该方法有机溶剂用量少,富集倍数高,适用于食品及环境样品中的污染物提取。Seyed[15]建立了基于生物吸附的DLLME技术从水样中提取BPA,在水样中加入甲醇作为分散溶剂,硝酸纤维素生物表面活性剂作为提取溶剂,涡旋离心,胶体相用于微萃取进行HPLC分析,水样中BPA的回收率为98.0%～103.3%。Rezaee等[16]以氯仿为萃取剂,丙酮为分散剂,建立了水样中BPA的DLLME方法,该方法处理样品仅用时3 min,效率远远高于未添加分散剂的液液微萃取法,回收率(93.4%～98.2%)较为满意,可用于河水和自来水中环境内分泌干扰物的含量测定。

1.3 微波辅助萃取

MAE可以通过微波处理并分离基质中的成分来提高萃取效率,缩短提取时间和试剂用量[17]。利用微波直接加热溶液,与传统加热技术相比,提取时间更短(从20 h到25 min),溶剂体积更小(从200 mL到20 mL)。薛鸣等[18]将粉碎后的罐装食品加入正己烷溶液置于微波萃取仪中,105 ℃条件下处理20 min,之后加入乙腈进行萃取,利用固相萃取柱净化。方法比较了皂化提取、超声提取和MAE后,得出MAE萃取方法下双酚类环氧衍生物含量最高,回收率70.46%～103.44%。Liu等[19]利用MAE法提取河水沉积物中BPA,方法以甲醇为提取剂,在110 ℃条件下处理15 min,采用硅胶柱净化,经乙酸乙酯和正己烷(体积比为4∶6)混合液洗脱,经GC-MS分析测定目标物含量。经验证,该方法稳定性良好,回收率高于73%。MAE优化的实验参数较为简单,与传统的萃取技术相比,最突出的优点在于溶剂用量少,快速,可同时测定多个样品,因而广泛用于环境中有机污染物的检测。

1.4 固相萃取

SPE技术集分离、净化、富集于一体,具有萃取效率高、使用范围广等特点。SPE与LLE相比具有更高的的选择性、更低的溶剂消耗量[20]。SPE主要有两种样品净化手段,一种是直接吸附样品中的目标物,使其与杂质分离,之后将目标物洗脱,达到分离和富集的效果;另一种是吸附样品基质中的杂质,直接将目标物洗脱富集[21]。常见检测双酚类物质的SPE吸附剂包括C18、N-丙基乙二胺(PSA)、N-乙烯吡咯烷酮与二乙烯基苯混合物(HLB)、弗罗里硅土等,为产生更好的净化效果,可将SPE小柱单个或多个串联结合使用。宁文吉等[22]建立了测定塑料瓶装乳酸饮料中的BPA含量的液相色谱-串联质谱方法,样品去除脂肪和蛋白质之后,采用HLB柱净化,随后上机检测,当取样量为10 g时,方法检出限为0.001 μg/kg,回收率在100.9%～107.5%之间。张品等[23]利用在线SPE结合UPLC-MS/MS的方法测定乳制品中4种内分泌干扰物,用X-Bridge C8柱进行富集,随后上机检测,结果表明液态奶和奶粉中BPA的定量限分别为0.5 μg/kg和1.0 μg/kg,该结果低于欧洲和丹麦机构推荐的安全限值5 μg/kg,达到法规要求。利用SPE技术提取净化样品,其提取效率高,回收率高,试剂消耗少,符合现代化检测要求,是目前应用最广泛的样品前处理技术。

1.5 固相微萃取

SPME技术以SPE为基础,在石英玻璃纤维上涂布固定相(高分子涂层或吸附剂)作为吸附介质,对样品中的有机分子进行萃取和富集。其装置集采样、萃取、浓缩、进样于一体,大大加快了分析检测的速度,克服了传统固相萃取先解吸后进样的缺点,极大地简化了样品预处理过程,操作时间短,样品量小,无需萃取溶剂,选择性高[24]。Amayreh等[25]研究电增强固相微萃取技术在邻苯二甲酸酯、双酚类及海水样品测定中的应用,优化了影响萃取时间、应用潜力和强度的各种实验条件,有利于提高目标分析物的萃取效率。样品置于容量瓶中磁力搅拌,SPME纤维和金属丝混入样品中,加直流电,搅动20 min,进GC-MS分析。测定海水样品中BPA回收率为73.9%～87.1%。Kirschner等[26]将可再生硅藻土作为薄层吸附材料,96孔酶标板作为萃取装置,建立了高通量HPLC方法分析环境水样中的BPA,样品预处理仅用2.8 min,检出限为8 μg/L,有效提高了样品处理效率,缩短分析时间。

1.6 基质固相分散萃取

MSPD非常适合提取固体、半固体或高黏性食品和生物基质。将样品与吸附剂混合,然后用少量溶剂清洗,或在洗脱前将分散剂吸附剂材料装填在固相萃取小柱中。基质固相分散萃取结构简单,用途广泛,可以一步完成萃取和净化,大大缩短了分析时间和溶剂消耗[27,28]。邵兵等[29]利用此法从鸡蛋和牛奶中同时提取BPA、壬基酚和辛基酚,样品与C18粉末混合,用10 mL乙醇洗脱,洗脱液蒸发至干,剩余部分重新溶解在二氯甲烷-正己烷中,用氨基丙基固相萃取法去除样品中的脂质,之后进行LC-MS/MS测定。结果表明,BPA的检出限约为0.10 μg/kg,平均回收率为82%～91%。蔡言红等[30]利用磁性竹炭为吸附剂的基质固相分散萃取法结合HPLC测定水中双酚S的含量。水样调整pH至4,加入2.5 g氯化钠和自制的磁性竹炭30 mg,旋涡振荡使双酚S吸附于磁性竹炭,丢弃水相,再加入甲醇振荡使双酚S解吸并溶于甲醇中,所得溶液以Spherigel C18色谱柱进行分离和紫外检测。结果表明,双酚S检出限为0.05 μg/L,回收率为90.6%,可以满足对水样中双酚S定性定量检测的需求。MSPD简化了样品均匀化、提取净化等过程,试剂消耗量少,耗时短,回收率高。

1.7 QuEChERS

QuEChERS因具有快速(quick)、简单(easy)、经济(cheap)、有效(effective)、稳定(rugged)、安全(safe)的特点而得名。该技术是由乙腈萃取分配和分散固液萃取过程组成的一种前处理方法,常用于检测农药、兽药、真菌毒素、持久性有机污染物残留[31]。QuEChERS方法大大简化了操作步骤,有效避免了复杂样品前处理过程中目标物的损失,具有回收率高、可分析样品种类广、溶剂用量小、提取时间短等显著特点[32]。QuEChERS常与溶剂提取相结合共同用于前处理过程,于紫玲等[33]建立了同时测定水产品中四溴双酚A和六溴环十二烷的UPLC-MS/MS方法。样品前处理采用QuEChERS方法,均质生物样品用水分散后加乙腈提取,经C18分散固相萃取净化。该方法测得平均回收率为74.0%～121%,四溴双酚A和六溴环十二烷的检出限分别为0.04～0.16 μg/kg和0.12～0.55 μg/kg。

综上可知,DLLME与传统的LLE法相比具有许多固有的优点,比如操作简单、溶剂消耗量低、浓缩倍数高、易实现自动化,在样品制备方面具有很大的潜力。在众多的样品制备技术中,SPE因其快速、自动化、高富集因子和高选择性等优点被认为是应用最广泛的技术。与LLE相比,SPE使用较少量的毒性溶剂,但仍然需要大量的有机溶剂和一次性萃取小柱。MSPD可减少样品和吸附剂用量,扩大吸附剂的容量,避免萃取柱堵塞。萃取和预浓缩过程中依然需要消耗有机试剂,所以在选择有机试剂时,尽可能选择毒性较小的离子液体试剂代替有机溶剂,在预处理方法上降低环境污染,保护人体健康。

2 检测方法

2.1 液相色谱法

LC-UV具有分析速度快、线性范围宽的特点,常用于分析极性强、挥发性低、稳定性差的化合物[34]。双酚类化合物含有酚羟基,属于中等极性,沸点较高,因此适用于HPLC分析。UV线性范围宽、重现性好,但灵敏度较低,仅依据保留时间定性,可能出现假阳性结果[35]。王延翠等[36]建立了在线SPE-HPLC同时测定水样中BPA和BPS的新方法。水样经过滤,用C18柱在线富集,用Spherigel C18柱分析,紫外检测波长为323 nm。BPA和BPS线性关系良好,回收率为90%～98%,检出限分别为0.017 μg/L和0.028 μg/L,适用于环境水样中BPA和BPS的同时测定。

大多数双酚有荧光吸收,而荧光检测器(FLD)仅对有荧光吸收的物质有响应,因此LC-FLD选择性好,灵敏度高,常用于分析多环芳烃等痕量物质[37,38]。宣栋樑等[39]建立了SPE-LC-FLD测定婴幼儿奶瓶迁移出的BPA的方法,水浴浸泡后的奶瓶浸出液经GDX-502柱固相萃取,Hypersil-ODS色谱柱分离测定,采用甲醇-水(70∶30, v/v)为流动相、在荧光激发波长为230 nm、发射波长为315 nm条件下检测。该方法的线性范围为0.05～5 mg/L,检出限为0.000 2 mg/L,平均回收率为104%。

在LC-MS分析法中,质谱检测器利用化合物的质荷比实现分离、丰度比实现定量,集高灵敏度和高选择性能于一体,串联质谱相比于单四极杆质谱可以提供更多的结构信息,定性和定量能力更准确,因此在复杂基质检测中用途更为广泛[40]。双酚类物质易于失去羟基氢带负电荷,因此一般在电喷雾离子化负反应模式(ESI-)下扫描。龚文杰等[41]建立了环境水中四溴双酚A的SPE-UPLC-MS/MS分析方法。水样经HLB小柱净化浓缩后,Shim-pack XR-ODSII色谱柱分离,ESI-多反应监测(MRM)模式下检测,以保留时间以及特征离子对定性,内标法定量。结果四溴双酚A在1.00～100.0 μg/L内呈良好线性关系,方法检出限为0.03 μg/L,定量限为0.1 μg/L,平均回收率为96.2%～105.0%。本方法分析速度快、灵敏度高,可用于环境水中四溴双酚A的分析测定。Song等[42]建立了LC-MS法测定食品基质中双酚A的检测方法,以甲醇-水从食品基质中提取待测物,经SPE富集,采用ESI-模式选择反应监测(SRM),方法定量限为0.08～2.0 μg/L,回收率为66%～127%。Cheng等[43]建立了超高效液相色谱(UHPLC)-MS/MS测定乳制品中21种双酚的分析方法,样品经QuEChERS方法提取净化,采用UHPLC-MS/MS方法定量测定。方法定量限为0.02～5 μg/kg,回收率为88.2%～108.2%。

2.2 气相色谱法和气相色谱-质谱法

GC具有选择性好、灵敏度高、分离能力强等优点,适用于分析弱极性、低沸点化合物。由于双酚类物质沸点较高,常需要衍生化转化为低沸点易挥发物再进行分析[44,45]。双酚结构中含有酚羟基官能团,对游离的酚羟基进行衍生化,可以提高分离度和灵敏度,改善峰形。克选[46]建立了加速溶剂萃取后利用GC-MS测定土壤中BPA的检测方法。样品采用加速溶剂萃取,经硅胶柱净化,以HP-5MS色谱柱,采用GC-MS全扫描和选择离子扫描进行分析。方法检出限为0.01 mg/kg,平均回收率为82.5%～101.7%。该方法简便快速,灵敏度及准确度高,可用于土壤中BPA的测定。黄会等[47]建立了测定水产品中辛基酚、壬基酚和BPA的GPC-SPE-GC-MS法。样品经乙酸乙酯超声提取,凝胶过滤-固相萃取净化,七氟丁酸酐衍生化,进行GC-MS分析检测,方法检出限为0.1 μg/kg,回收率BPA不低于81.3%,适用于水产品中BPA的检测。

2.3 酶联免疫吸附测定法

ELISA已广泛应用于食品分析中,用于检测和定量蛋白质、酶、维生素和其他自然存在的物质,也用于测定食品污染物,如微生物、细菌毒素、霉菌毒素、杀虫剂、合成代谢激素和兽药。该方法易于实施,具有良好的敏感性和特异性,无需昂贵的设备。ELISA测定主要取决于免疫原和产生的抗体类型[48]。BPA为小分子,本身不能启动免疫反应,需要与蛋白质结合形成完整的抗原。Feng等[49]建立了一种基于直接半抗原包被模式的间接竞争ELISA方法,用于检测自来水和海水中的BPA。该方法有别于传统方法,采用包被抗原的模式,大大提高了检测的灵敏度,检出限可达0.27 ng/mL,添加回收率为70%～142%。梁嘉艺等[50]对HPLC与ELISA分别测定水中BPA含量的方法进行了比较,检测结果得出两种方法均具有良好的相关性,HPLC的相关系数为0.998 7, ELISA的相关系数为0.985 8,二者均满足检测要求,ELISA可用于样品初筛与初步评估,而HPLC用于精准确证。

2.4 毛细管电泳法

离子的电泳迁移率不同,在电场中移动的速度也不一样。CE以高压电场为驱动力,以毛细管为分离通道,依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离[51]。CE的优点是操作简单,试样量少,分离效率高,成本较低,但在迁移时间的重现性、进样准确性和检测灵敏度方面,比LC法稍逊。高芳芳等[52]在毛细管电泳的胶束电动色谱模式下,利用压力辅助电动进样方式在线富集测定水样中4种酚类雌激素。对进样电压、进样时间等因素进行了考察,并与传统的压力进行比较。结果表明,在优化条件下(-9 kV, 2.1 kPa, 0.4 min), 4种酚类物质在7 min内基线分离,检出限为0.007 1～0.017 mg/L,回收率为75.6%～110.1%,该方法不需要其他试剂,只需对电泳仪的参数进行适当优化即可实现分析物的在线富集,方法快速简便,自动化程度高。

2.5 生物传感器法

生物传感器是一种对生物物质敏感并将其浓度转换为电信号进行检测的仪器,该方法专一性强,分析速度快,准确度高,易实现自动化。但这种方法中酶标物质容易失活,费时且重现性较差。顾翔源等[53]采用柠檬酸还原法合成银纳米粒子并修饰核酸适配体,BPA与核酸适配体结合发生变构效应使其产生银纳米粒子聚集,其特征峰以及颜色发生变化,研究体系特定波长吸光度比值A608/A418与BPA浓度的变化关系。该比色法在0.5～50 ng/mL呈现良好的线性关系,湖水样品中检出限为0.3 ng/mL。Rahman等[54]基于阻抗测定原理研制了BPA的无标记免疫传感器。同样采用BPA的结构类似物双酚酸偶联BSA作为抗原制备了抗BPA多克隆抗体,并固定化于传感器表面。当血浆中BPA与抗体在传感器表面相互作用时,可引起微小的质量和阻抗变化,从而实现对BPA的灵敏检测。该方法对BPA的检出限为0.3 ng/mL,线性范围为1～100 ng/mL。

2.6 超临界流体色谱-串联质谱法(SFC-MS/MS)

超临界流体色谱(SFC)[55]是一种新型分离技术,它是气相色谱和液相色谱的结合。超临界流体在超过温度和压力临界点时,液相和气相之间的界限消失,因此该物质同时具备气体和液体的高扩散性和低黏度,有利于快速分离分析[56]。使用压缩CO2作为主要流动相,加入少量有机试剂作为改性剂,增大流动相的极性,扩大分析物范围,兼具正向色谱的选择性和反相色谱的易用性,并且更加绿色环保。SFC-MS/MS[57,58]在色谱的基础上连接质谱检测器,将仅依靠保留时间定性的色谱分离检测发展到依靠三重四极杆质谱检测器定性定量,提高了分析的准确性和灵敏度,减少有机试剂消耗,方法绿色环保[59]。本课题组Zhang等[60]开发了一种基于SFC-MS/MS同时测定聚碳酸酯中17种双酚类物质的方法,采用CO2作为主要流动相添加甲醇为改性剂,17种双酚在DIOL色谱柱,11.72 MPa背压下可在9 min内实现分离测定。回收率为81.8%～114.5%,定量限为0.5～2.5 μg/kg。该方法灵敏度高,峰形良好,可用于同时测定聚碳酸酯中多种双酚类化合物。

综上所述，这些分析方法对双酚检测的选择性和精密度均较好。HPLC是分析食品样品中较为普遍的方法。LC-MS/MS是最常使用的分析方法,利用LC高效分离、MS准确定量的能力可实现有机污染物精准高效的检测。生物传感器法具有快速、高效、低成本、操作简便的特点,可实现连续动态监测。ELISA属于快速检测方法,具有快速、灵敏、特异性强的特点,可在短时间内鉴别样品。在大批量样本现场检测中,可利用ELISA进行初筛,阳性样品利用实验室质谱进一步定量检测。SFC-MS/MS法可用作UPLC-MS/MS的新型替代方法测定双酚类物质,方法快速可靠,绿色环保,或成为未来双酚仪器分析检测发展方向。

3 结论

双酚类物质在食品和环境介质中广泛存在,若长期暴露在双酚污染的环境中,即使是低浓度,人体健康也会受到威胁,因此对食品和环境中双酚含量进行监测和评估具有重要意义。由于食品及环境样品的基质较为复杂,分析前需结合不同程度的样品前处理以除去基质干扰,对目标物进行有效的提取分离净化。目前常用SPE、SPME、MSPD、QuEChERS等富集净化技术,同时依靠LC-UV、LC-MS/MS、生物传感器、CE等检测方法实现准确定量分析。考虑到双酚在日常生活中的危害性较强,建立高效、快速和灵敏的定性定量分析方法具有重要意义,双酚检测技术未来的研究方向要围绕简化样品预处理过程和开发高效便捷的检测方法展开。