夏天无配方颗粒特征图谱研究△

金辉辉，徐斌，黄妍，童玉华，薛瑾，王昕佳，姚建标*

1.浙江康恩贝制药股份有限公司，浙江 杭州 310052；2.浙江省中药制药技术重点实验室，浙江 杭州 310052；3.浙江中医药大学，浙江 杭州 310052；4.江西天施康中药股份有限公司，江西 鹰潭 335000

夏天无为罂粟科植物伏生紫堇Corydalisdecumbens(Thunb.)Pers.的干燥块茎，分布于浙江、江西、江苏、安徽、湖北、河南等地区，为国家地理标志保护产品[1]。主要化学成分为生物碱类，此外还含有机酸类、淀粉、鞣质等[2-3]。夏天无具行气活血，通络止痛之功效，文献报道其对心血管系统、消化系统、内分泌系统等具有明显的药理作用[4-11]，为民间常用草药，常用于治疗高血压、中风偏瘫症、风湿性关节炎及腰肌劳损等，通常研末冲服、煎汤内服[12]。

夏天无配方颗粒是夏天无饮片经现代提取技术及制剂工艺精制而成，在临床上可以替代夏天无饮片，因此对其研究有着十分积极的意义。原阿片碱与盐酸巴马汀为夏天无的特征性成分，同时也是其主要有效成分。本研究参照《中药配方颗粒管理暂行规定》制备配方颗粒，以此为基础，建立了夏天无配方颗粒的特征图谱方法，确定了10个共有特征峰，为夏天无配方颗粒的质量控制及工艺研究提供了参考。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪、Agilent1260高效液相色谱仪串联质谱Q-TOF 6530A；Sartorius BS 201S 电子天平(北京赛多利斯仪器有限公司)；DK-S26 水浴锅(上海精宏)；KQ-250DB 数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药

原阿片碱(中国食品药品检定研究院，批号：110853-201404，纯度：99.7%)；盐酸巴马汀(中国食品药品检定研究院，批号：110732-201611，纯度：86.8%)；延胡索乙素(中国食品药品检定研究院，批号：110726-201516，纯度：99.8%)；D-四氢药根碱(上海源叶生物科技有限公司，批号：M30J8S38887，纯度≥98%)；比枯枯灵(成都普菲德生物有限公司，批号：150917，纯度≥98%)。

夏天无药材由金华市益康医药有限公司和江西天施康中药股份有限公司提供，由浙江康恩贝制药股份有限公司炮制。经浙江康恩贝制药股份有限公司何厚洪高级工程师鉴定均为正品。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相：以乙腈为流动相A，以三乙胺醋酸溶液(三乙胺8 mL，冰醋酸30 mL，加纯水稀释至1000 mL)为流动相B，梯度洗脱(0～15 min，13%A；15～20 min，13%～17%A；20～30 min，17%A；30～50 min，17%～24%A；50～55 min，24%～36%A；55～60 min，36%～95%A)；检测波长：285 nm；流速：1 mL min-1，柱温：40 ℃，进样量：10 μL。

2.2 夏天无配方颗粒的制备

参照《中药配方颗粒管理暂行规定》，以9批夏天无饮片为源头，最终制得15批夏天无配方颗粒。制备工艺：取夏天无饮片，加水煎煮3次，每次1 h，加水量依次为6倍、6倍、6倍，滤液浓缩至相对密度约至1.05～1.10(60 ℃)，干燥，粉碎，加糊精适量，混匀，制粒，即得夏天无配方颗粒。

2.3 对照品溶液和供试品溶液的制备

2.3.1 对照品溶液制备方法 精密称取延胡索乙素、原阿片碱、盐酸巴马汀、D-四氢药根碱适量，加甲醇稀释成每1 mL含延胡索乙素50 μg，原阿片碱30 μg，盐酸巴马汀10 μg，D-四氢药根碱50 μg的混合对照品溶液。

2.3.2 供试品溶液的制备 取夏天无配方颗粒1 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入氨水1 mL润湿，再精密加入甲醇30 mL，称定质量，超声提取40 min，放冷，再次称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，滤液蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至10 mL量瓶中并定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3.3 阴性供试品溶液的制备 取糊精，按2.3.2项下方法，制备阴性供试品溶液。

2.4 方法学验证

2.4.1专属性考察 取延胡索乙素、原阿片碱、盐酸巴马汀、D-四氢药根碱混合对照品溶液、夏天无配方颗粒供试品溶液和阴性供试品溶液按2.1项下方法进样检测，阴性供试品溶液无干扰，供试品溶液中色谱峰分离良好，见图1。方法专属性良好。

注：A.空白溶液；B.混合对照品溶液；C.夏天无配方颗粒供试品溶液。图1 夏天无配方颗粒专属性考察

2.4.2 精密度试验 按2.3.2项下方法制备供试品溶液，重复进样5次，各共有峰相对保留时间的RSD均<0.18%，仪器精密度良好。

2.4.3 稳定性试验 按2.3.2项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12、24 h进样测定，各共有峰相对保留时间的RSD均<0.35%。供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.4 重复性试验 取同一批号样品，按2.3.2项下方法制备6份，各共有峰相对保留时间的RSD均<0.31%。该方法重复性良好。

2.5 特征峰的确定及对照指纹图谱的生成

按2.3.2项下方法，制备15批夏天无配方颗粒供试品溶液，按2.1项色谱条件测定，记录色谱图。通过HPLC特征图谱选取了10个共有峰作为特征峰，建立了夏天无配方颗粒的对照特征图谱，见图2。其中峰5为原阿片碱，该色谱峰峰形尖锐稳定，分离良好，且为夏天无药材中重要质量控制指标成分，故确定原阿片碱为参照峰(S峰)。

2.6 相对保留时间的确定

通过15批夏天无配方颗粒的HPLC图，生产对照指纹图谱(见图3)，同时记录各共有峰的保留时间，计算相对于S峰的保留时间值(见表1)。各峰的平均相对保留时间值分别为0.190(峰1)、0.287(峰2)、0.827(峰3)、0.952(峰4)、1(S)、1.255(峰6)、1.335(峰7)、1.396(峰8)、1.449(峰9)、1.836(峰10)；RSD分别为0.404%、0.668%、0.233%、0.229%、0%、0.206%、0.361%、0.198%、0.205%、0.243%；将各峰平均相对保留时间值定为特征图谱规定值，检测相对保留时间应在规定值的±5%以内。

2.7 特征图谱峰定性

按2.3.2项下方法制备供试品溶液，进行质谱分析。提取峰4、5、9、10成分的二级质谱图进行解析[13]，再结合对照品分析，确定其结构。

3 讨论

本实验对不同厂家不同型号色谱柱进行考察：色谱柱1：(Welch Xtimate®C185-Micron 250 mm×4.6 mm，Part Number：00101-21043，Serial Number：411501757)、色谱柱2：(Welch Utimate®XB-C185-Micron 250 mm×4.6 mm，Part Number：2101.78，Serial Number：211303178)、色谱柱3：(Aglient ZORBAX SB-C185-Micron 250 mm×4.6 mm，Part Number：880975-902，Serial Number：USCL067039)，色谱柱4：(Athena C18120®5-Micron 250 mm×4.6 mm，Part Number：LAEQ-462571，Serial Number：T9370008)。结果显示，Aglient SB-C18、Athena C18色谱柱检测得到的色谱图相对分离度更佳，峰形更为尖锐，且峰更多，能更全面表达色谱信息，更适宜做特征图谱，建议用Aglient SB-C18与Athena C18色谱柱。

注：4.D-四氢药根碱；5.原阿片碱；9.延胡索乙素；10.盐酸巴马汀。图2 夏天无配方颗粒对照特征图谱

表1 15批夏天无配方颗粒特征图谱测定结果

图3 15批夏天无配方颗粒特征图谱

本实验对色谱柱温度(20、25、30、35、40 ℃)进行考察。发现温度对色谱图分离和峰形影响较大，温度越高峰形越尖锐，分离度也有提高，因此确定40 ℃为最佳柱温。

在供试品溶液制备时，考察了不同提取溶剂体系(甲醇-氨水、三氯甲烷-甲醇-氨水、三氯甲烷-氨水)，结果显示，三氯甲烷-氨水提取体系有部分峰丢失，三氯甲烷-甲醇-氨水提取体系在0～10 min内杂峰比较少。但考虑到三氯甲烷为有毒试剂，标准汤剂为纯水提取，且结合色谱图峰的分离情况，最终选择甲醇-氨水体系。

图4 特征图谱色谱峰定性

4 结论

中药材本身成分复杂，中医药理论强调其多成分的整体性，中药特征图谱在质量评价中起着尤为重要的作用。本实验建立了夏天无配方颗粒的特征图谱来监测整体质量，验证了方法稳定性、重复性等，确立了10个特征峰；并利用对照品和液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)对其特征图谱特征峰进行了定性，为夏天无配方颗粒的工艺研究及质量控制提供了参考。