远志抗惊厥活性部位的研究△

何希瑞，赵泽丰，陈旭飞，付有兰，田雪，李永生，毕学苑*

1.遵义医科大学 珠海校区生物工程系，广东 珠海 519041；2.西北大学 西部资源生物与现代生物技术重点实验室，陕西 西安 710069；3.西安交通大学 附属红会医院，陕西 西安 710054

远志为远志科植物远志PolygalatenuifoliaWilld.或卵叶远志PolygalasibiricaL.的干燥根，始载于《神农本草经》。性辛、味苦，归心、肾、肺经，有益智安神、祛痰开窍以及消散痈肿之效，主治由于痰阻心窍而致神志恍惚癫痫发狂等症。近年来研究表明，远志的主要活性成分包括寡糖酯类、皂苷类及有机酸类化合物等[1]，使得本品具有改善记忆[2]、保护神经[3]、抗痴呆[4]以及抗抑郁[5]等功效。此外，远志还具有抗惊厥的活性[6-7]，但对其抗惊厥作用的活性部位鲜有报道。本研究通过制备远志的70%乙醇提取物，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯与甲醇萃取，得到4种萃取物，并建立小鼠惊厥模型评价各萃取物的抗惊厥活性，筛选出远志抗惊厥的活性部位，明确其抗惊厥的物质基础，以期为远志在临床抗惊厥中的应用及药物开发提供实验依据。

1 材料

1.1 仪器

XS105电子天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；YSD-4G电刺激仪(安徽正华生物仪器设备有限公司)；XZC-4B旋转棒疲劳仪(山东省医学科学院设备站)；R206D旋转蒸发仪(上海申生科技有限公司)；98-1-N电子调温电热套(天津市泰斯特仪器有限公司)。

1.2 药品与试剂

远志药材购自西安同仁堂，由西安交通大学附属红会医院副主任中药师魏桂芳鉴定。戊四唑(阿法埃莎化学有限公司，批号：10180463)；3-巯基丙酸(北京百灵威科技有限公司，批号：LH40O138)；卡马西平(北京百灵威科技有限公司，批号：LLA0P07)；聚山梨酯-80(天津市登峰化学试剂厂)；石油醚(天津市富宇精细化工有限公司)；乙酸乙酯(天津市富宇精细化工有限公司)；二氯甲烷(天津市致远化学试剂有限公司)；甲醇(天津市富宇精细化工有限公司)；95%乙醇(天津市富宇精细化工有限公司)；0.9%氯化钠注射液(西安京西双鹤药业有限公司)。

1.3 实验动物

SPF级雄性昆明小鼠，体质量(24±2.0) g，购自西安交通大学医学部实验动物中心，动物合格证号：SCXK(陕)2007-001。饲养温度20～25 ℃，相对湿度45%～65%，自由饮水和摄食。

2 方法

2.1 供试药品制备

称取远志药材36.0 g，用70%乙醇溶液于索氏提取器中回流提取3次，合并提取液，回收溶剂得到粗提物13.5 g，分别用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯与甲醇萃取3次[8]，合并萃取液后减压浓缩，分别得到石油醚萃取物(PE)1.3 g；二氯甲烷萃取物(DCM)1.8 g；乙酸乙酯萃取物(EA)2.2 g；甲醇萃取物(ME)2.4 g。临用前配制成含5%吐温-80的萃取物水溶液。

2.2 Ⅰ期动物实验

2.2.1 最大电休克(Maximal Electroshock，MES)致惊厥模型 使用20 V、60 Hz、0.25 s的交流电，于小鼠双耳尖部涂抹0.9%氯化钠溶液，连接电极后给予电刺激，小鼠后肢强直时认定为惊厥[9]。正式实验前一天进行预筛，出现惊厥的小鼠用于实验。取筛选过的小鼠36只，按照随机数字表法分为6组，每组6只[10]。分别为0.9%氯化钠溶液(NS)组(5%聚山梨酯-80)、阳性药物对照组(卡马西平53 mg kg-1)、PE组(300 mg kg-1)、DCM组(300 mg kg-1)、EA组(300 mg kg-1)及ME组(300 mg kg-1)。分别于腹腔注射药物0.5、1、2、3、4 h后，记录小鼠的惊厥数，初步评价各萃取物的抗惊厥活性。

2.2.2 戊四唑(Pentylenetetrazole，PTZ)致惊厥模型 分组及给药剂量同2.2.1项下方法，各组小鼠给药后0.5 h皮下注射PTZ 85 mg kg-1。按照Racine标准[11]，造模后小鼠出现颈部肌肉及前肢痉挛视为阵挛性发作，出现后肢僵直(持续5 s或以上)，失去平衡并伴有四肢抽动视为强直性发作。小鼠独自置于笼中观察30 min，记录阵挛性发作数，强直性发作数，潜伏时间以及病死数。同时计算阵挛性发作率，强直性发作率和病死率。

2.3 Ⅰ期动物实验

2.3.1 最大电休克模型半数有效量测定(MES ED50) 根据Ⅰ期动物实验结果，对在300 mg kg-1下有效的萃取物进行Ⅱ期动物实验。取小鼠24只，分为6组，每组4只。分别为NS组(5%聚山梨酯-80)、卡马西平组和有效萃取物组(50、100、150、200 mg kg-1)，于腹腔注射药物0.5 h后进行电刺激，记录小鼠的惊厥数，用Probit法计算0.5 h的ED50。

2.3.2 戊四唑模型半数有效量测定(PTZ ED50) 分组同2.3.1项下方法，有效萃取物(300、400、500、600 mg kg-1)腹腔注射0.5 h后皮下注射PTZ 85 mg kg-1，强直性发作持续时间小于5 s视为药物具有保护作用。小鼠独自置于笼中观察30 min，记录强直性发作数，潜伏时间以及病死数，计算注射PTZ后小鼠强直性发作数的ED50。

2.3.3 3-巯基丙酸模型半数有效量测定(3-Mercaptopropionic acid，3-MP ED50) 分组及给药剂量同2.3.2项下方法，腹腔注射有效萃取物后0.5 h皮下注射3-MP 60 mg kg-1，强直性发作持续时间小于5 s视为药物具有保护作用。小鼠独自置于笼中观察30 min，记录强直性发作数，潜伏时间以及病死数，计算注射3-MP后小鼠强直性发作数的ED50。

2.3.4 神经毒性测定(Neurotoxicity，NT) 采用旋转棒法评价各萃取物的神经毒性[12]。正式实验前一天对小鼠进行适应性训练和筛选。将小鼠置于直径2.54厘米，24 r min-1的木棒上，3 min内从木棒上掉落小于3次者用于正式实验。取筛选后的小鼠16只，分为四组，每组4只。分别为有效萃取部位(600、800、1000、1200 mg kg-1)进行腹腔注射，3 min内从木棒上掉落3次以上者认为有神经毒性，反之认为无神经毒性，记录毒性反应小鼠只数，计算给药后0.5 h对小鼠的半数中毒量(TD50)。

2.4 数据统计与处理

3 结果

3.1 Ⅰ期动物实验结果

3.1.1 最大电休克模型结果 MES实验结果如表1所示，在300 mg kg-1剂量下，相比于NS、PE与DCM对抗电刺激引起的惊厥效果不明显；EA表现出一定的抗惊厥活性，而ME抗惊厥活性较为显著(P<0.01)。值得注意的是，与阳性药卡马西平(Carba) 相比，ME的保护活性在给药1 h后明显下降，3 h后无保护作用，而卡马西平在3 h后仍具有保护作用。我们推测可能由于甲醇萃取物所含极性成分在体内代谢较快所致。

表1 远志不同萃取物的抗惊厥活性筛选Ⅰ期实验(n=6)

注：n1/n2表示惊厥数/实验小鼠总数；惊厥数的统计采用χ2检验；**表示与模型组相比，P<0.01；—表示给药相同体积的0.9%氯化钠溶液(含5%聚山梨酯-80)。

3.1.2 戊四唑模型结果 PTZ实验结果如图1所示，在300 mg kg-1剂量下，相比于NS组，PE与DCM对抗戊四唑诱导的惊厥差异无统计学意义。提示远志PE与DCM萃取物的抗惊厥作用不明显，EA(P<0.05)与ME(P<0.01)对惊厥发生的潜伏时间延长具有统计学意义，表现出显著的抗惊厥活性。与NS相比，ME延长潜伏时间达100%以上(P<0.01)(图1A)，且能降低小鼠的病死率(P<0.05)(图1B)。综上所述，我们选取甲醇萃取物进行下一步实验。

3.2 Ⅱ期动物实验结果

Ⅱ期动物实验结果见表2和表3。远志甲醇萃取物在MES、PTZ及3-MP模型下的ED50值分别为143.3、517.1、469.9 mg kg-1，表明远志甲醇萃取物在上述模型下均能够表现出显著的抗惊厥活性。神经毒性结果显示，ME对小鼠的神经毒性较低，TD50值为890.54 mg kg-1，根据ED50与TD50值计算得到MES模型下的保护指数(Protective index，PI)(ED50/TD50)为6.2，阳性药卡马西平的PI为6.4。

4 讨论

《神农本草经》记载远志具有祛痰开窍，安神益智，多用于心悸失眠、健忘等症。现代药理学研究发现远志还具有显著的抗惊厥活性，但其抗惊厥活性部位尚未阐明。本研究采用索氏提取器对远志用70%乙醇进行提取，得到的提取物依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯与甲醇萃取，得到不同极性的萃取物。采用MES模型及PTZ模型对远志4个不同极性的萃取物的抗惊厥活性进行系统筛选。结果表明甲醇萃取物的抗惊厥活性最好。进而，本研究采用MES，PTZ及3-MP模型对甲醇萃取物进行了进一步的抗惊厥活性评价，研究发现远志甲醇萃取物具有显著的抗惊厥活性。

注：潜伏时间采用单因素方差分析统计，发作率和病死率采用χ2检验统计。*与模型组相比，P<0.05，**与模型对照组相比，P<0.01。图1 远志不同萃取物抗PTZ致小鼠惊厥实验结果

表2 远志甲醇萃取物的抗惊厥活性实验结果

注：模型中n1表示惊厥数组，n2表示实验小鼠数，n3表示产生神经毒性的小鼠数。*与模型对照组相比，P<0.05，**与模型对照组相比，P<0.01；—表示给药相同体积的0.9%氯化钠溶液(含5%聚山梨酯-80)。

表3 定量评价远志甲醇萃取物的抗惊厥活性

注：ED50是根据给药0.5 h后未发生惊厥的小鼠只数计算的；括号内数字为95%置信区间。

药物在MES模型的作用机制被认为与抑制Na+通道的过度放电[14]有关。本研究结果显示，远志甲醇萃取物对MES诱导癫痫小鼠具有显著保护活性，提示甲醇萃取物可能含有抑制电压依赖性Na+通道的化学成分。

值得注意的是，远志的毒副作用被广泛报道，高剂量远志水提物具有明显的肝毒性及肾毒性[19]。远志中的皂苷类成分也被报道具有胃肠毒性[20]。研究发现小鼠腹腔注射1000、1200 mg kg-1的远志甲醇萃取物后，小鼠出现明显的镇静以及共济失调现象，但1200 mg kg-1剂量组小鼠腹腔注射后在24 h内全部病死，表现出较大的毒副作用，这在新药开发中是不容忽视的问题。本研究中，虽然甲醇萃取物的抗惊厥保护指数(PI=6.2)与阳性药卡马西平(PI=6.4)接近，但进一步对其进行减毒增效的研究是非常必要的。