高原地区血细胞VHL基因变化与红细胞增多症的相关性分析

马晓燕，刘淑敏

(青海红十字医院检验科，青海西宁 810000)

红细胞增多症的发生、发展具有显著的个体差异及种族差异，有研究表明，高原低氧导致促红细胞生成素(EPO)水平上升，从而引起骨髓造血能力升高，是疾病发生的重要因素[1]。EPO受各方面因素的影响，在供氧不足的情况下会造成缺氧诱导因子-1(HIF-1)水平升高，HIF-1能结合缺氧反应元件，从而刺激EPO的表达，最终诱发红细胞增多症。VHL基因指导合成的VHL蛋白能借助于泛素化从而控制HIF-1水平，所以，在红细胞增多症患者的发病过程中具有重要影响。同时，最新研究表明，部分疾病易感性与VHL基因拷贝数存在重要的联系[2]。本研究主要分析了高原红细胞增多症患者VHL基因拷贝数的变化情况及二者的相关性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2016年5月至2017年5月本院收治的红细胞增多症患者30例作为研究组，其中男19例，女11例；年龄26～59岁，平均(48.19±2.21)岁；所有患者均世居高原，海拔为4 500 m。纳入标准：(1)男性患者血红蛋白(Hb)超过180 g/L，女性患者Hb超过160 g/L，合并发绀、呼吸困难、头晕和毛细血管充血等；(2)高原地区持续居住时间超过10年。排除标准：(1)其他疾病导致的红细胞增多；(2)合并严重肝、肾功能障碍；(3)妊娠哺乳期女性。选取同期健康体检人员30例作为对照组，其中男16例，女14例；年龄22～58岁，平均(42.34±1.85)岁，在海拔超过4 000 m的高原持续生活超过1年。两组研究对象性别、年龄等一般资料比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，有可比性。两组研究对象均对本研究知情同意。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2检测方法 采集两组研究对象空腹静脉血5 mL，乙二胺四乙酸抗凝后，-30 ℃条件下保存检测。DNA提取应用全血基因组试剂盒(美国，OMEGA)，提取研究对象血液样本中的总DNA，应用分光光度仪(美国，Nanodrop)定量检测DNA。β-actin作为本研究的看家基因，实时荧光定量PCR标准品为本实验室保存的人β-actin质粒。实时荧光定量PCR反应体系为SYRB(含dNTP、Mg2+、Taq酶、PCR buffer等)12．5 μL，灭菌水10．5 μL，模板DNA 1 μL，10 pmol/L的上、下游引物共 1 μL。PCR扩增条件：95 ℃条件下持续加热10 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s读板，40个循环。温度从50 ℃上升到95 ℃，每上升0.2 ℃读板1 s，分析熔解曲线，计算VHL基因及β-actin的比值，从而得到VHL基因拷贝数。

1.3观察指标 对比两组研究对象VHL基因拷贝数、一般资料及外周血常规指标，分析基因拷贝数变化与红细胞增多症的相关性[3]。

1.4统计学处理 采用SPSS22.0统计软件对数据进行分析，对计量资料进行正态检验，再分别描述正态分布资料、非正态分布资料组间比较应采用的统计学方法，结果部分先描述计量资料正态检验结果(提供相应的参考值)，证实是正态或非正态分布后再采用正确的方法进行后续的组间比较。采用logistic回归模型进行相关性分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1两组研究对象VHL基因拷贝数和一般资料比较 研究组VHL基因拷贝数显著低于对照组，研究组年龄、EPO均显著高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)；两组研究对象性别构成比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 两组研究对象VHL基因拷贝数和一般资料比较

2.2两组研究对象外周血常规指标比较 研究组白细胞计数(WBC)、红细胞计数(RBC)、Hb和血细胞比容(Hct)均显著高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 两组研究对象外周血常规指标比较±s)

2.3红细胞增多症与临床因子的相关性 研究组VHL基因拷贝数、EPO、RBC和Hb与红细胞增多症呈显著正相关(P<0.05)。见表3。

表3 红细胞增多症与临床因子的相关性

2.4红细胞增多症风险因素的logistic回归模型分析 VHL基因拷贝数和EPO是红细胞增多症的重要风险因素(P<0.05)。见表4。

表4 红细胞增多症风险因素的logistic回归模型分析

3 讨 论

红细胞增多症是人类生活在高原低压缺氧环境时红细胞出现代偿性过度增生的问题，从而使血液黏滞度显著上升，并引起血流阻力的升高，进而导致患者出现一系列症状、体征的临床综合征[4]。

高原红细胞增多症可以说是临床较常见的一种慢性高原病。随着海拔的上升(尤其是海拔高度超过3 000 m后)，临床发病率呈显著上升的趋势，这是因为人体长期生活在高原慢性缺氧条件下，会出现一系列相应变化，如RBC、Hb和Hct水平显著上升[5]。这是人体对高海拔缺氧状态的代偿保护机制。不过人体的自适应保护机制突破自身耐受程度时就会出现高原病，也就是高原适应衰退，从而给心脏、肺、肝、脾等器官带来一定程度的不良影响。

红细胞增多症的病理作用机制十分复杂，简言之就是高原居民机体中的动脉血氧分压水平和动脉血氧饱和度水平下降，动脉二氧化碳分压水平上升，导致细胞内部出现超微病理改变，进一步刺激炎症细胞因子、低氧诱导因子和EPO的表达，使造血干细胞持续分化，血液中Hb、RBC和Hct水平上升，通过这一途径来满足人体器官耗氧，适应低压、低氧的恶劣环境[6]。如果低氧环境长期无法得到有效改善，就会影响人体内部的代偿平衡，导致器官、组织发生生理病理变化，进一步损伤人体器官、组织。因此，分析红细胞增多症的发病机制是预防、治疗红细胞增多症的主要途径，寻找该病的标志因子则是早期诊断的关键技术[7]。尤其是随着近年来我国高原地区的持续深入开发及移居高原居民数量的上升，慢性高原病特别是红细胞增多症的预防及治疗成为高原地区卫生服务的主要内容之一。

人类VHL基因位于染色体3p25，包括2个内含子及3个外显子，编码长度为5 kb，参与构成多种复合蛋白体，同时，可调节人体中低氧诱导表达[8]。本研究结果显示，红细胞增多症患者VHL基因拷贝数显著低于健康个体，差异有统计学意义(P<0.05)。提示该病患者VHL基因合成蛋白质水平下降，进一步影响HIF-1α的降解功能，使HIF-1α水平持续上升。HIF-1α水平持续升高会影响到EPO表达，增加EPO的生成及分泌。在这一背景下，人体中的红细胞就会出现继续增殖的问题。因此，红细胞增多症是EPO基因影响低氧诱导区的位点，从而诱发T-G突变及T/G杂合等错序排列，同时，低氧诱导区的GG区与TT区比较，表达频率上升[9]。提示红细胞增多症患者的易感基因位点往往合并基因突变，同时，也为分子遗传层面分析该病提供了新的思路。此外，有研究分析了高原肺水肿患者，结果显示，这些患者普遍存在HLA-DR6及DQ4基因易感性，提示移居高原的红细胞增多症患者同样存在HLA-DR6、DQ4的易感性[10]。

随着基因组工程的进展，有研究表明，高原健康个体之所以可以适应极端气候，主要是受VEGFA基因、AKT3基因和NOS3基因影响的VEGF信号通路及血管生长因子协同发挥作用的结果。有研究还发现了可适应极端气候基因的单核苷酸多态性(SNP)位点，如红细胞的位点rs4590656、Hb位点rs100731和藏族居民红细胞增多症患者的红细胞的位点rs1570360[11]。有研究在红细胞增多症易感基因的SNP位点检测过程中发现，移居的汉族居民及世居的藏族居民在发病率方面存在一定的区别，ANGPTL4SNP的遗传距离为0.061，VEGFASNP的遗传距离为0.043 8，NOS3T基因的遗传距离为0.08[12]。这是长期居住高原人群红细胞增多症发病的易感性标示之一。

VHL基因能借助于泛素化调控HIF-1α表达水平，从而间接影响各种因子的转录功能。这一途径也就是“VHL/HIF通路”。红细胞增多症患者中，因为VHL基因拷贝数下降，根据中心法则计算会使患者VHL基因中的蛋白质水平下降，从而影响到对HIF-1α的降解。这样一来，患者HIF-1α水平就会持续上升。HIF-1α水平的持续上升会导致EPO表达的上升，从而导致红细胞增多症的发生、发展[13]。

本研究结果显示，研究组WBC、RBC、Hb和Hct等均显著低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)；同时，研究组VHL基因拷贝数、EPO、RBC和Hb与红细胞增多症呈显著正相关(P<0.05)。这是因为长期生活在高海拔地区者经数千年的自然选择后，形成了独特同时复杂的低氧耐受机制，使其Hb水平不会因为低氧而持续上升，甚至低于平原地区汉族人群的平均Hb水平。有研究表明，长期居住在我国西藏和青海地区的藏族居民Hb水平略低于移居的汉族居民，但女性Hb水平略高于移居的汉族居民，不同性别的居民在Hb水平方面存在显著差异。同时，有研究表明，与居住在海拔高度类似的安第斯山居民比较，藏族居民平均Hb水平要低10%左右[14]。

藏族居民独特的适应能力推测与其基因存在联系。缺氧可显著提高细胞中EPAS1蛋白质水平，从而强化糖酵解酶及EPO的表达，维持人体内部的氧平衡及Hb水平稳定。高原地区居民VHL基因表达的上调与Hb水平的下降存在着不容忽视的重要联系。

VHL基因变化已成为诊断红细胞增多症的重要分子学标准。红细胞增多症患者中，VHL基因下降的阳性率超过90%。这是因为VHL基因拷贝数下降会激活JAK2-STAT途径，使红细胞过度增殖。不过高原地区红细胞增多症患者VHL基因变化状况及发生频率高低方面的研究较少。有研究表明，红细胞增多症患者往往合并心、脑器官严重损害，主要是心、脑血管异常及栓塞，同时，部分患者合并肝、肾功能及胃肠功能障碍。表明在红细胞增多症恶化的过程中，容易导致患者内脏器官受损，给患者造成致命性病理学损伤。因此，需引起医务人员对红细胞增多症的高度重视，从而及时诊治，防止红细胞增多症患者出现并发症[15]。

本研究进行的红细胞增多症临床因素的logistic回归模型分析结果显示，VHL基因拷贝数和EPO是红细胞增多症的重要危险因素(P<0.05)，提示基因领域的相关研究对分析红细胞增多症的病因具有不容忽视的重要价值。不过需注意的是，截至目前，研究人员的相关数据对探索不同低压、低氧环境条件下人体的基因变化尚无严格规范的标准，推测是因为能影响基因改变的因素较少。此外，基因与基因之间的作用及基因与环境之间的作用也需要纳入高海拔疾病基因研究中。因此，在后续的研究过程中应该应用多态性基因数据及单体型图，从而改善潜在易感位点的检测质量。与此同时，已有的基因领域研究结果存在的可变性，提示受种群遗传背景等方面的影响，人体的基因表达水平也存在一定程度的不同。红细胞增多症患者可能存在其他的潜在影响因素。因此，综合应用多种方法进行研究，有利于确定在不同高海拔地区种群缺氧耐受情况的遗传基础，从而帮助人们更加有效地预防红细胞增多症的发生。

综上所述，高原地区红细胞增多症患者普遍存在VHL基因拷贝数下降的问题，这与病情的发生、发展密切相关。