阳江地区某猪场塞内卡病毒抗原和抗体的检测与分析

黄 元，刘 涛，陈锦良，王晓虎，陈 晶，梁培新，黄 武，向 华

（1.广东省农业科学院动物卫生研究所/广东省兽医公共卫生公共实验室/广东省畜禽疫病防治研究重点实验室/农业部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站，广东 广州 510640；2.广东源丰农业有限公司，广东 阳江 529938；3.广东宏丰农牧有限公司，广东 英德 513036 ）

塞内卡病毒病是由小核糖核酸病毒科塞内卡病毒属的塞内卡病毒A（Seneca virus A,SVA）引起的一种主要感染猪的病毒性传染病。病毒直径约为25～30 nm，正二十面体结构，分子结构为单股正链非分段RNA［1］。该病毒可引起猪产生类似水疱样病变，感染猪的鼻吻、蹄冠等部位［2］，临床上出现鼻孔囊泡破裂和侵蚀，蹄冠状动脉带囊泡破裂后会导致猪只跛行［3］。美国、巴西等地的临床研究表明，1周龄仔猪感染SVA后，临床表现为肥胖、肌无力、食欲不振、嗜睡、唾液分泌过多、皮肤充血、腹泻，并且有神经系统表现，有些仔猪会突然死亡。临床症状一般持续3～10 d，然后在存活的仔猪中消失。对仔猪进行常规剖检，表现为肾脏淤点出血，舌头出现溃疡性损伤［4］。该病本身死亡率不高，但易造成继发感染，可致仔猪死亡率高达30%～70%［5］。由于与口蹄疫等水疱性疾病难以区分，容易造成恐慌。

塞内卡病毒最初引起人们的注意是在胎牛血清或胰酶污染的细胞培养液中［6］。2008年SVA在美国的猪群中发现，继而席卷美国、加拿大、巴西、澳大利亚、新西兰、泰国、哥伦比亚等国家［7］，在世界范围内引起广泛关注。2015年我国广东首次发现SVA，目前SVA已在我国多个省市暴发［8-10］。但我国对SVA的临床报道仍然很少，对其发病猪群的抗体水平也未见检测分析数据。

2017年4月，广东省阳江地区某猪场发生疑似塞内卡病毒感染症状。为进一步了解SVA为防控积累数据，本研究对该猪场采集的患病组织和血清进行病毒分离，建立了微量血清抗体中和试验方法，并进行了抗原和抗体检测分析。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试的疑似SVA发病猪蹄部水泡皮和16份猪血清均来自广东省阳江地区某猪场。

主要试剂：TakaRa ExTaq DNA聚合酶、pMD19-T质粒和DH5α感受态细胞，购自宝生物工程（大连）有限公司；病毒RNA/DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和质粒小量快速抽提试剂盒，购自美基生物科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 RT-PCR检测 水泡皮研磨后离心10 min（12 000 r/min，4℃）， 取 上 清， 用病毒RNA/DNA提取试剂盒提取病毒总核酸进行RT-PCR检测。引物按照文献［11］合成，针对VP1-2A基因，上游引物序列为5’-TCGGTTTACTCCGCTGATGGTTGG-3’；下游引物序列为5’-AGGACCAGGATTGGTCTCGATATC-3’。RT-PCR反应条件：42℃ 30 min；94℃ 5 min；94℃ 1 min、55℃ 1 min、72℃ 1.5 min，35 个循环；72℃ 5 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，观察结果。

1.2.2 基因克隆和序列测定 PCR产物电泳后用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收980 bp左右的片段，连接至pMD19-T载体，用质粒小量快速抽提试剂盒提取质粒，由华大基因公司测序。对核苷酸序列进行BLAST在线分析，并用MEGA6软件与GenBank上下载的参考毒株进行序列比对分析。

1.2.3 病毒分离及滴度测定 水泡皮研磨后离心10 min（12 000 r/min，4℃），上清液用0.22 μm滤器过滤后接种至PK-15细胞，培养5 d后若无病变产生则冻融3次再次接种细胞，产生病变后的培养产物在PK-15细胞上进行病毒传代，培养产物10倍梯度稀释后接种96孔板，测定对PK-15细胞的TCID50［7］，72 h后观察病变，以Kärber法计算结果。

1.2.4 微量血清抗体中和试验 按照文献［12］的方法进行微量血清抗体中和试验。将待测血清于56℃下水浴1 h，以除去血清中的补体及其他干扰物质。处理后的待测血清用含2%胎牛血清的MEM培养液进行2倍梯度稀释，然后在96孔细胞培养板中每孔加50 μL；病毒液稀释至100 TCID50/50μL，每孔加入50 μL，于37℃二氧化碳培养箱中放置1 h后加入PK-15细胞悬液，同时设立病毒回归对照；置37℃二氧化碳培养箱中培养72 h后观察结果。

2 结果与分析

2.1 RT-PCR结果

从病料提取核酸进行RT-PCR，对PCR产物进行电泳，结果观察到接近1 000 bp的单一条带（图1）。将PCR产物连接到pMD19-T载体，其测序结果表明，获得长度为980 bp的VP1-2A序列。

图1 SVA VP1-2A的RT-PCR扩增产物电泳结果

2.2 VP1-2A核苷酸序列分析

对本研究获得的毒株命名为CHGDYJ-2017，将所克隆的VP1-2A基因序列与GenBank上的SVA同区段序列进行比对分析，建立系统进化树（图2）。与 CH-GDYJ-2017同源性最高的是2015年美国毒株USA/GBI29/2015（KT827251），同源性为99.2%；同源性最远的是2008年美国毒株SVV-001（DQ641257），同源性为91.3%，表明结构蛋白基因VP1附近仍旧是变异较快的区域，但并未显现明显的时间或地域相关的变异特征。

在我国流行毒株中，与本研究获得的毒株CH-GDYJ-2017关系最近的是CH-HN-2017（97.1%），最远的是CH-01-2015（92.2%），表明我国的SVA病毒已经在多地流行并且呈现一定的变异趋势。

图2 SVA VP1-2A核苷酸序列系统进化树

2.3 病毒分离及滴度测定结果

将水泡皮处理产物接种PK-15细胞后，盲传4代后产生明显细胞病变。在PK-15细胞上传代4次后测定病毒滴度，滴度可达107TCID50/0.1mL。

2.4 抗体中和试验结果

从采集的16份血清样本数据来看，无论猪只发病与否，均有中和抗体出现（表1），说明均有过感染。9头种猪全部感染SVA，其中6头发病，发病率为66.7%。按抗体效价大于等于1∶64为阳性计算［13］，受检的16份样品中有11份阳性，总感染率为68.8% 。6头发病种猪的中和抗体效价非常高，3头临床未发病的种猪的抗体效价也都达到了1∶1 024以上，最高达1∶4 096。

表1 抗体中和试验结果

3 结论与讨论

塞内卡病毒（SVA）作为一种新的外来病原，已经在我国部分地区流行，未来几年可能会继续呈现蔓延的趋势，由于当前市场尚无SVA疫苗出售，随着传播范围的扩大，必将造成更大的经济损失［14］。虽然其危害没有口蹄疫那样严重，但是由于其临床症状与口蹄疫极其类似，因此，为了鉴别和区分，避免不必要的恐慌，做好疫病的预防和监控迫在眉睫。相关部门应及时关注国内外疫情相关动态，掌握塞内卡病毒的流行趋势及其带来的环境风险，确保第一时间对SVA进行合理的应对和处置。

本次抽检的16份血清样本全部来自广东阳江某猪场。从中和试验的结果来看，抗体阳性率为68.8%（≥1∶64）。其中种猪抗体阳性率为100%，抗体效价均达到1∶1 024以上，未发病猪抗体阳性率为50%。说明SVA的免疫原性很强，能够刺激动物机体产生很高的抗体水平。发病猪中和抗体效价非常高，与FMD临床发病相比，SVA临床发病猪康复快，与临床实际相一致。这次猪场发病均为种猪，未见哺乳仔猪、保育猪、肥猪发病。这与国外文献报道的仔猪死亡率高不一致［4-5］。因此我们检测了除母猪以外的其他阶段猪的中和效价，发现多个阶段猪均有感染，只是未见临床表现，后续将进一步加强临床观察和深入研究其具体原因。

本研究从广东阳江地区某猪场的疑似病料中检出SVA并进行分离，建立了微量血清抗体中和试验方法，为SVA的流行病学研究提供了工具［15］。对同为小核糖核酸病毒科的口蹄疫病毒（FMDV）的研究表明，FMDV的抗原具有高度变异性［16-17］，病毒核衣壳的变异顺序为VP1＞VP2＞VP3＞VP4，由于VP1基因的核苷酸易发生变异，因此，在分子流行病学调查中可通过比较分析VP1基因的核苷酸序列之间的差异来分析各毒株之间的变异情况，为研究不同毒株的亲缘关系奠定基础［17］。SVA与FMDV同属小核糖核酸病毒科，在核苷酸序列分析上可以采用同样的方法［18］。对VP1基因测序比对的结果表明，分离株与美国2015年毒株USA/GBI29/2015同源性较高（99.2%），而与我国毒株同源性最高仅为97.1%（2017年毒株CH-HN-2017）。从系统进化树来看，目前我国流行毒株已经产生多个分支。这表明SVA可能先后多次传入我国［19］。此外，广东株（CH-01-2015）和湖北株（HB-CH-2016）序列比对同源性为100%，说明这两个地区之间毒株传播迅速，短期内就已经跨越多个省份，需要更加密切关注SVA在我国其他省份的流行情况［20］。我国对外来疫病的防控制度和应对措施还需要进一步完善［15］。本研究选取不同国家和我国不同地区不同时间段具有代表性的毒株，对部分序列遗传关系进行分析，如需获得更加准确的遗传进化关系，可对各流行毒株的全基因组序列进行全面系统的分析。