三阴性乳腺癌组织ICAM-1和Ki-67的表达及临床意义研究

何 欣 ，刘凤磊 ，王 涛 ，李晓琴 ，刘 玮

（1.甘肃省肿瘤医院，甘肃 兰州 730050；2.甘肃省人民医院，甘肃 兰州 730000；3.甘肃省医学科学研究院转化医学研究中心，甘肃 兰州 730050）

乳腺癌是具有高度异质性的肿瘤，2013年ST.Gallen乳腺共识基于免疫组化染色对乳腺癌进行了分型，分为Luminal A-like型、Luminal B-like型、HER-2阳性型及三阴性型。三阴性乳腺癌（TNBC）即雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）及人表皮生长因子受体（HER-2）均为阴性表达[1-3]，因其基因表型的异质性，导致其组织学形态、治疗反应和预后均同其他类型有明显差异[4-6]。

细胞间黏附分子（Inter Cellular Adhesion Molecule-1，ICAM-1）又称CD54，是免疫球蛋白超家族中一种重要的细胞黏附分子[7]，它的作用是介导细胞-细胞、细胞-细胞外基质间的相互结合，从而参与肿瘤细胞血管生成以及侵袭和转移，与肿瘤细胞的生物学行为密切相关[8]。研究发现，ICAM-1在许多恶性肿瘤中高表达，且与肿瘤的发生、发展、浸润和转移密切相关[7-9]。

Ki-67是细胞增殖的相关抗原，在增殖细胞核中表达，主要用于判断细胞的增殖活性，在所有活动的细胞周期（G1、S、G2和有丝分裂期）中表达，而在G0期不表达。Ki-67增殖指数高低与许多肿瘤的分化程度、浸润转移以及预后密切相关，也是恶性肿瘤预后的重要参考指标之一[10]。在三阴性乳腺癌中，Ki-67指数的预后价值并不十分明确。

本研究通过免疫组化回顾性检测ICAM-1、Ki-67蛋白在72例三阴性乳腺癌组织及40例非三阴性乳腺癌组织中的表达，并持续跟踪随访，探讨其表达与临床病理特征及预后的关系，以期为三阴性乳腺癌的个体化治疗提供更多信息。

1 资料与方法

1.1 临床资料

（1）收集甘肃省肿瘤医院2011—2013年收治的乳腺癌患者，经穿刺活检或外科手术切除，病理结果确诊为浸润性乳腺癌标本。患者均为女性，其中三阴性乳腺癌标本72例，患者年龄30～77岁，中位年龄52岁；肿瘤大小：＜2 cm的29例，≥2 cm且≤5 cm的41例，＞5 cm的2例；浸润性导管癌58例，浸润性小叶癌1例，其他病理分型13例。非三阴性乳腺癌标本40例。所有标本经4%中性甲醛溶液固定后，常规石蜡包埋。

（2）所有三阴性乳腺癌患者均进行随访，随访时间22～74个月，中位随访时间62个月，其中死亡15例，5年生存率为79.17%。6例病人失访或死于其他疾病。

1.2 方法

通过粗针穿刺的方式于化疗前收集接受新辅助化疗的乳腺癌患者的癌组织标本，对于未接受新辅助化疗的乳腺癌患者，则是在根治手术后收集癌组织标本。三阴性乳腺癌组织病例是通过免疫组化染色选择ER、PR、Her-2均为阴性以及免疫组化染色Her-2为1+或2+而FISH检测无Her-2基因扩增的病例。

ICAM-1兔抗人单克隆抗体购自英国Abcam公司（货号ab53013），Ki-67抗体购自福建迈新生物技术开发有限公司，应用免疫组化检测ICAM-1蛋白的表达，具体操作按试剂盒说明进行。PBS代替一抗作为阴性对照，用已知阳性标本作为阳性对照。

1.3 结果判读

所有免疫组化片均由两位副高以上病理医师独立双盲观察判读，ICAM-1蛋白在细胞膜及细胞质中着色，判定标准采用阳性细胞比例和着色深浅相结合的方法，每张切片随机选取5个视野，细胞数≤25%计1分，25%～50%计2分，＞50%计3分；显微镜下无着色计0分，着色为浅黄颗粒计1分，深黄或棕色颗粒计2分。最后两者所得评分相乘，0分和1分为阴性表达，2、3、4和6分为阳性表达。Ki-67蛋白表达于细胞核，选取至少5个表达最高的代表性高倍视野（热点区），根据阳性细胞所占比例计算阳性率。按照2013年St.Gallen会议共识，Ki-67阳性细胞＜14%定义为低表达，Ki-67≥14%定义为高表达[1，11]。

1.4 统计学分析

所有数据采用SPSS 16.0统计学软件进行分析，两独立样本组间比较采用χ2检验，生存分析采用Kaplan-Meier法，并进行Log-rank检验。

2 结果

2.1 三阴性乳腺癌、非三阴性乳腺癌组织中ICAM-1的表达

ICAM-1表达于肿瘤细胞膜及细胞质中（见图1），40例非三阴性乳腺癌组织中ICAM-1的阳性表达率为32.50%（13/40），72例三阴性乳腺癌组织ICAM-1的阳性表达率为68.06%（49/72），两者比较，差异具有统计学意义（χ2=13.145，P＜0.05）。见表1。

图1 免疫组化标记ICAM-1蛋白在TNBC中的表达情况

表1 ICAM-1在三阴性乳腺癌、非三阴性乳腺癌中的表达

2.2 Ki-67在三阴性乳腺癌组织和非三阴性乳腺癌组织中的表达

72例三阴性乳腺癌组织中，Ki-67的高表达率为88.89%（64/72）；40例非三阴性乳腺癌组织中，Ki-67的高表达率为70.00%（28/40）。三阴性乳腺癌组织中Ki-67高表达率明显高于非三阴性乳腺癌组织（P＜0.05），见表 2。

2.3 ICAM-1蛋白的表达与三阴性乳腺癌临床病理特征的关系

表2 三阴性乳腺癌和非三阴性乳腺癌组织中Ki-67的阳性表达

ICAM-1表达与患者年龄、肿瘤大小、脉管癌栓、神经侵犯无关（P＞0.05），但与组织学分级、淋巴结转移、TNM分期、Ki-67高表达相关（P＜0.05），见表 3。

表3 ICAM-1在三阴性乳腺癌组织中的表达与临床病理特征的关系（人）

2.4 Ki-67在三阴性乳腺癌组织中高表达与临床病理特征的关系

Ki-67高表达率与患者年龄、脉管癌栓、神经侵犯、淋巴结转移、TNM分期无关（P＞0.05），但与肿瘤大小、组织学分级相关（P＜0.05），见表 4。

2.5 ICAM-1蛋白的表达与三阴性乳腺癌5年生存率的关系

Kaplan-Meier生存分析显示：49例三阴性乳腺癌ICAM-1蛋白阳性表达组患者的5年生存率为71.4%（35/49），23例三阴性乳腺癌ICAM-1蛋白阴性表达组的5年生存率为95.7%（22/23）；三阴性乳腺癌患者中，ICAM-1蛋白阳性表达组的5年生存率显著低于ICAM-1蛋白阴性表达组（P=0.027）。见图2。

2.6 Ki-67蛋白表达与三阴性乳腺癌5年生存率的关系

Kaplan-Meier生存分析显示：三阴性乳腺癌患者中，Ki-67蛋白低表达组患者的5年生存率为100.0%（8/8），Ki-67蛋白高表达组患者的5年生存率为76.6%（49/64），Ki-67蛋白高表达患者的5年生存率下降明显，但与Ki-67蛋白低表达组的5年生存率比较，差异无统计学意义（P=0.145）。见图3。

3 讨论

3.1 ICAM-1的功能及其与部分肿瘤发生发展的相关性研究

表4 Ki-67在三阴性乳腺癌组织中表达与临床病理特征的关系（人）

图2 ICAM-1蛋白低表达组与ICAM-1蛋白高表达组三阴性乳腺癌患者的5年生存率比较

图3 Ki-67蛋白低表达组与Ki-67蛋白高表达组三阴性乳腺癌患者的5年生存率比较

乳腺癌是一类异质性明显的恶性肿瘤，其发生、发展是个多基因、多步骤、多阶段的过程。近年来，随着现代医学技术和分子生物学的发展，乳腺癌标志物的研究日益成为热点。三阴性乳腺癌因对内分泌治疗和Herceptin靶向治疗效果欠佳、预后差、易复发及转移等特点，对于其分子标志物的研究越来越受到研究者的关注。

细胞间黏附分子（ICAM-1）又称 CD54，是免疫球蛋白超家族中重要的细胞黏附分子[7]。黏附分子分为五大类，包括钙黏附素家族、整合素家族、选择素家族、免疫球蛋白超家族和透明质酸黏素[12]，ICAM-1编码人类的基因定位于第19号染色体上，包括6个内含子和7个外显子[13]，该蛋白质的相对分子质量为80～110 KD，主要表达于血管内皮细胞和免疫细胞表面，与淋巴细胞功能相关抗原-1（LFA1）相结合，在正常组织结构的维持、炎症与免疫应答、伤口修复、凝血与血栓形成以及肿瘤浸润和转移等多种生理、病理过程中均具有重要作用[14]。ICAM-1在人类正常乳腺、大脑、结肠、食管、肾、肝、卵巢、胰腺、前列腺、直肠、皮肤、小肠、宫颈组织表达缺失，但在正常脾脏、肺、淋巴结、胸腺、睾丸和骨组织中阳性表达[2]。ICAM-1在肿瘤学中的作用正在研究中，它在部分肿瘤中表达上调，与疾病进展、预后差、抵抗化疗有关[2]。有研究发现，ICAM-1在许多恶性肿瘤中高表达，且与肿瘤的发生、发展、浸润和转移密切相关[7-9]。

3.2 ICAM-1与Ki-67蛋白在乳腺癌中的表达及其与三阴性乳腺癌临床病理特征的关系

本研究应用免疫组化检测ICAM-1蛋白在72例三阴性乳腺癌组织、40例非三阴性乳腺癌组织中的表达，结果发现，三阴性乳腺癌组织中ICAM-1阳性表达率明显高于非三阴性乳腺癌组织（P＜0.05）。进一步对ICAM-1蛋白表达与临床病理学参数的相关性分析显示，ICAM-1表达与患者年龄、肿瘤大小、脉管癌栓、神经侵犯无关（P＞0.05），但与组织学分级、淋巴结转移、TNM分期、Ki-67高表达相关（P＜0.05）。此外，本研究中Kaplan-Meier生存分析显示：ICAM-1蛋白阳性表达组患者的5年生存率显著低于ICAM-1蛋白阴性表达组（P＜0.05）。此结果提示，三阴性乳腺癌的恶性程度较高，临床预后较差，且ICAM-1的表达与三阴性乳腺癌患者的恶性生物学行为及生存关系密切。

我们同时应用免疫组化检测Ki-67蛋白在72例三阴性乳腺癌组织及40例非三阴性乳腺癌组织中的表达，结果发现，三阴性乳腺癌组织中Ki-67高表达率明显高于非三阴性乳腺癌组织（P＜0.05），提示三阴性乳腺癌细胞增殖活跃。对Ki-67蛋白表达与临床病理学参数的相关性分析显示，Ki-67高表达率与肿瘤大小、组织学分级相关（P＜0.05），但与患者年龄、脉管癌栓、神经侵犯、淋巴结转移、TNM 分期无关（P＞0.05）。Ki-67是细胞增殖的相关抗原，在增殖细胞核中表达，主要用于判断细胞的增殖活性，说明癌细胞有丝分裂期越活跃，其体积越大、组织分级越高。Kaplan-Meier生存分析显示：Ki-67蛋白低表达组患者的5年生存率为100.0%，Ki-67蛋白高表达组患者的5年生存率为76.6%，Ki-67蛋白高表达患者的5年生存率下降明显，此结果对于判断及预测三阴性乳腺癌患者预后有一定价值，但差异无统计学意义（P=0.145），可能是由于本次Ki-67蛋白低表达组患者样本量较少（仅8例），有待进一步扩大样本量进行研究。

3.3 ICAM-1、Ki-67蛋白在三阴性乳腺癌患者预后判断及治疗中的可能作用

通过本研究我们认为，ICAM-1、Ki-67蛋白在三阴性乳腺癌组织中呈高表达，且ICAM-1、Ki-67高表达与三阴性乳腺癌患者的恶性生物学行为及生存关系密切，提示ICAM-1、Ki-67蛋白有可能成为三阴性乳腺癌患者预后判断的重要指标。同时，ICAM-1有望成为TNBC治疗的新靶点，改变TNBC治疗只能依靠单纯性化疗的现状，并为其早期诊断及靶向治疗提供一定的依据。