菌种超低温保存法与人工传代法的比较

◎ 梁梅娟，陈亚波，苏佩冰

（中山市食品药品检验所，广东 中山 528437）

菌种检验是微生物检验工作必不可少的环节，且数量、品种繁多，由此菌种的保存非常重要。菌种的长期保存，一直是科研工作中的重要内容。

冷冻干燥法曾被认为是最为理想的保存方法，但已有文献报道，认为该保存法会使菌种的性质发生改变[1-2]。人工传代法的操作虽简单，但费时、费工、效率低，且反复传代会增加菌种污染的机会。

因而寻求一种简单易行、较长期有效的菌种保存方法一直是实验室研究的热点和所期望的目标。本文对超低温法（-80 ℃）与人工传代法保存菌种的效果，结合文献资料进行了比较观察，其中超低温法（-80 ℃）采用两种方法保存，菌种保存液法及瓷珠菌种保存管法，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 保存菌的菌种名录

本研究共使用的15种菌种，分别购自广东省微生物研究所菌种保藏中心及美国ATCC。自编号、菌种名称、菌种编号见表1。

表1 菌种一览表

1.2 菌种保存液的配制

K2HPO412.6 g、柠檬酸钠0.98 g、MgSO4·7H2O 0.18 g、KH2PO43.6 g，甘油88 g，加蒸馏水至1 000 mL，121 ℃灭菌20 min后，置于4 ℃备用[3]。

1.3 菌种保存方法

将已经按照菌种说明进行复苏的菌种接种于相应的肉汤培养基中，（36±1）℃培养所需要的时间。培养结束，将菌液离心后加入新鲜的培养基，再加入等体积的菌种保存液，分装于菌种冻存管，标注菌种名称、菌种编号、代数及传代日期，冻存于-80 ℃超低温冰箱中。另外，所有菌种按常规方法作人工传代法保存，将其保存在半固体培养基或琼脂斜面上，置于4 ℃冰箱保存，并每隔3个月传代1次，其中铜绿假单胞菌每隔1个月传代1次，传代次数不超过5代，副溶血性弧菌保存于室温，每周传代1次。

1.4 瓷珠菌种保存管法

从培养18 h以上的平板上刮去新鲜纯培养物于菌种保存管中，配成3～4麦氏比浊度的菌悬液。拧紧保存管，来回颠倒几次使细菌乳化，不能旋摇。用无菌移液器将菌种保存管内的液体吸取干净，妥善放置被吸出的液体。拧紧保存管，迅速将其置于-80 ℃超低温冰箱中。

1.5 菌种复检时间与鉴定项目

超低温保存菌种每隔半年、人工传代保存的菌种每次传代进行1次生物学性状鉴定[4]。

1.5.1 存活力测定

每隔一定时间用营养琼脂平板传种各种方法保存的菌种，检测细菌的存活情况。

1.5.2 典型生化反应检测

在检查存活力的同时，进行平板划线，观察菌落、菌体形态，革兰氏染色及显微镜下形态，检测有关典型生化反应特征，比较菌种的生物学特性与原菌种生物性特性的差异。

2 结果与分析

2.1 菌种保存情况的比较

据文献记载，一般耐受力较强的菌种在-80 ℃可保存15年以上，耐受力较低菌种如乙型溶血型链球菌，用低温保存方法，在-80 ℃可保存10年以上，不耐低温冷冻的菌种，在-80 ℃也可保存5年以上，大大延长了菌种存活时间[5]。而人工传代上述菌种，需每隔3个月传代1次。目前，本实验室已经对这两种方法保存菌种进行了2年的试验，保存菌种的效果见表2。

表2 15种菌种保存效果比较表

2.2 存活力和生物学特性发生改变的情况

采用超低温保存的菌种，不管是菌种保存液法还是瓷珠菌种保存管法，连续24个月存活均良好，对存活力、菌落形态、革兰氏染色及显微镜下形态、典型生化反应特征等指标，未发现改变，可以继续保存至更长的时间[6]。采用人工传代法保存的菌种存活周期为1～15个月，菌种传代2次鉴定1次，经过几次传代，存活力和生物学特性方面都有不同程度的下降和改变。且生物学特性均有不同程度的改变，需要重新购买菌种。

3 讨论

结果表明，超低温保存法比人工传代法保存时间长，且能保存菌种生物学特性稳定，特别是对于乙型溶血性链球菌、产气荚膜梭菌、副溶血性弧菌，单增李斯特氏菌等需要特殊方法保存的菌种。人工传代法，既费时、费力，又增加了菌种污染的机会。从本文对-80 ℃保存的15种菌种来看，是完全可达到较长期保存菌种又可临时使用的目的，不须进行较为繁琐的反复传代和减少菌种的污染。

通过对多种菌种的保存实践，对保存方法进行比较分析和长期观察，证明超低温保存方法（-80 ℃）是目前较为理想的菌种保存方法。其优点如下：①保持菌种生物学特性的稳定。经超低温保存方法保存的细菌、真菌，取出复苏，菌种长势良好，经鉴定未发现变异现象。②操作简单和经济。超低温保存方法只需经肉汤培养或盐水刮下菌液，加入等量保存液，分装冻存管，注明其保存日期，存放于-80 ℃中。③减少污染机会。超低温保存方法，菌种在冻存管内封存，需要时取出一支，避免了污染杂菌的机会。但是，对于那些耐受力特别低的菌种，还需要对菌种保护进行摸索、探讨，增强其耐受性，以达到与其他菌种相同的存活时间。

综上所述，超低温保存方法简单有效，易于掌握，无需特别的设备，尤其适宜于菌种品种多、菌种量大，使用频繁的检测机构作为保存菌种之用。特别是瓷珠菌种保存管的应用，是菌种的保存过程更加简单快捷，值得推广应用。