模式植物狗尾草响应不同干旱及盐胁迫表达的内参基因actin及其应用

张丽丽 赵辉 郭静远 夏启玉 贺萍萍 霍姗姗 屈静 符冬妹 郭安平

摘  要  为了研究应用于狗尾草响应不同干旱及盐胁迫基因表达的内参基因，本研究从网站https：//phytozome.jgi.doe. gov/pz/portal.html上获得狗尾草A10品系8个actin基因的cDNA序列，设计荧光定量PCR引物，以不同程度的干旱及不同浓度盐胁迫处理的狗尾草幼苗cDNA做模板，进行荧光定量PCR试验，通过实时荧光定量PCR扩增片段电泳分析，扩增曲线及溶解曲线综合分析，结果表明登录号Sevir.9G114100对应的actin基因是8个actin基因中最合适的内标基因。并对所选内标的实用性进行了验证，验证的结果与转录组数据的结果保持一致，证明所选内标基因可用于后续狗尾草响应不同干旱及盐胁迫狗尾草转录组基因表达的验证工作，为深入研究狗尾草功能基因奠定分子基础。

关键词  狗尾草;actin基因;干旱胁迫;盐胁迫;荧光定量PCR

中图分类号  S544+.3      文献标识码  A

Internal Reference Gene Actin of Setaria viridis and Its Application in Response to Different Drought and Salt Stress

ZHANG Lili， ZHAO Hui， GUO Jingyuan， XIA Qiyu， HE Pingping， HUO Shanshan， QU Jing， FU Dongmei， GUO Anping*

Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of

Biology and Genetic Resources of Tropical Crops， Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Hainan Key Laboratory for Biosafety Monitoring and Molecular Breeding in Off-Season Reproduction Regions， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract  In order to study the internal reference genes applied to the expression of different drought and salt stress genes in S. viridis， the cDNA sequence of 8 actin genes of S. viridis （accession A10.1） was obtained from https：//phytozome.jgi.doe. gov/pz/portal.html. The primers for real time PCR were designed， and the templates of cDNA for the seedlings of S. viridis treated with different concentrations of drought and salt stress were used. Through the amplification fragment electrophoresis analysis， amplification curve and dissolution curve comprehensive analysis of RT-PCR， the results indicated that the actin gene corresponding to accession number Sevir.9G114100 was the most suitable internal standard gene among the eight actin genes. The practicability of the selected internal standard gene was verified. The results of the verification were consistent with the results of the transcriptome data， suggesting that the selected internal standard gene could be used in the verify experiments of S. viridis gene expression response to different drought and salt stress， giving a molecular base for further study of the functional gene of S. viridis.

Keywords  Setaria viridis; actin gene; drought stress; salt stress; RT-PCR

DOI  10.3969/j.issn.1000-2561.2019.12.015

狗尾草（Setaria viridis）屬于单子叶植物纲禾本科黍亚科狗尾草属，黍亚科一般常分布在热带和亚热带地区，该科植物具有热带植物的典型特征，高粱、甘蔗、玉米、谷子等都属于黍亚科。拟南芥是典型的双子叶模式植物，对拟南芥基因分子机理的研究，为改良农作物、稳定和提高粮食产量奠定了理论基础。但由于在实际的应用中，许多粮食作物比如玉米、水稻等是禾本科的单子叶植物，而拟南芥为双子叶植物，与上述粮食作物亲缘关系较远。科学家把水稻作为禾本科的模式生物。因为水稻本身属于禾本科，又是重要的粮食作物，具有基因组小、易于转化等诸多优点，但是，水稻作为模式植物也有其先天的缺点。水稻的生长对环境温度的要求比较严格。并且在北方，每年只能种一季。因此急需一种生长周期短的新型禾本科模式植物[1]。而狗尾草几乎符合作为一种模式植物的所有要求：植株矮小、容易种植、能产生大量的自交系种子、基因组小、二倍体、生长周期短、容易诱变、容易转化，是非常优良的单子叶模式植物[2-3]，另外，狗尾草是C4植物，具有C4光合作用系统，在研究C4植物的光合作用机理方面，具有得天独厚的优势[4-5]。狗尾草和许多禾本科农作物，如谷子、玉米等，具有较近的亲缘关系，它们的基因功能应该具有较高的保守性。狗尾草对非生物胁迫耐受能力强，抗性基因丰富，是研究耐旱、耐热、耐盐等胁迫反应的重要模式植物[6]。

有研究人员以狗尾草为模式植物，通过NMU（N-Nitroso-N-methylurea）诱变，筛选到了一个花絮稀疏的突变体。通过BSA （bulk segregant analysis）重测序方法，鉴定到了突变基因;玉米中的同源基因突变后也表现出与狗尾草突变体相同的表型。这一研究充分证明了以狗尾草为模式植物进行玉米基因组功能研究的可行性[7]。

研究植物基因的表达情况是植物分子生物学领域的研究热点，荧光定量PCR（RT-PCR）技术已成为研究基因表达量的重要方法，研究植物基因的表达时需要选一个高度保守并且表达稳定的基因作为内参。由于常用的内参基因存在不稳定性，因此根据具体的试验条件筛选稳定合适的内参基因极为重要。肌动蛋白基因（actin）编码的肌动蛋白是真核生物细胞中一种普遍存在的组成型表达的看家基因，它參与细胞分裂、形态维持、信号传导、细胞器运动等多种重要生理活动[8-11]，除了有基因序列高度保守的特征外，还具有mRNA表达数量高，数量稳定等特性，是用于基因表达分析的理想内参基因[12-13]。目前尚未有文献报道应用于研究狗尾草响应不同干旱及盐胁迫基因表达的内参基因。本研究旨在狗尾草8个actin基因中筛选出一个表达最稳定的用于后续对狗尾草响应不同干旱及盐胁迫基因表达的验证工作，也方便之后进行基因表达分析时得到更为精确可靠的结果，为深入研究狗尾草功能基因奠定分子基础。

1  材料与方法

1.1  材料

植物材料为已测序完成的狗尾草A10品系，材料由美国Donald Danforth Plant Science Center的Thomas P. Brutnell 实验室提供，以A10品系经休眠处理的成熟种子为试验材料，研究适应于模式植物狗尾草响应不同干旱及盐胁迫表达的内参基因actin及其应用。

1.2  引物

本研究从网站https：//phytozome.jgi.doe.gov/ pz/portal.html上获得狗尾草A10品系的8个actin基因及需要验证的2个目的基因的cDNA序列，然后用Primer 5.0引物设计软件设计荧光定量PCR引物，引物序列如表1所示。

1.3  方法

1.3.1  对狗尾草幼苗进行干旱和盐胁迫处理  甘露醇模拟干旱胁迫处理培养基配制：1/2MS培养基，10 g蔗糖，pH 5.8，Gelzan植物凝胶4 g，在基础培养基内分别添加甘露醇，甘露醇的浓度梯度为0、100、200、300、400 mmol/L 5个梯度。NaCl盐胁迫处理培养基配制：在基础培养基内分别添加NaCl，NaCl的浓度为0、40、80、120、160 mmol/L 5个梯度。

将狗尾草种子播种至上述培养基进行培养，培养条件参照文献执行[14-15]。在培养皿中培养一周后分别取样0.2 g，在液氮中冷冻之后于70 ℃保存。

1.3.2  干旱及盐胁迫处理的狗尾草株系总RNA的提取及cDNA的合成  取上一步试验中干旱及盐胁迫处理的试验材料，用QIAGEN plant RNA

Kit试剂盒来提取狗尾草的总RNA。然后用Fermentas的反转录试剂盒将上面提取的RNA为模板合成cDNA的第1条链。

1.3.3  荧光定量PCR验证  荧光定量PCR 反应体系：SYBR Premix Ex Taq（2×）12.5 μL，Rox reference DyeⅡ（50×）0.5 μL，引物actin-F（10 pmol/L）和actin-R（10 pmol/L）各1 μL，cDNA模板1.0 μL，ddH2O 9.0 μL反应体系总体积为25 μL。荧光定量PCR的引物序列如表1所示，以狗尾草看家基因actin为内参。

荧光定量PCR程序为94 ℃，3 min;94 ℃，15 s;60 ℃，30 s;72 ℃，35 s;共40个循环。

2  结果与分析

2.1  狗尾草幼苗在干旱和盐胁迫处理下的生长情况

狗尾草幼苗在干旱和盐胁迫处理下第7天的生长情况如图1A和图1B所示，从图1中可以看出，随着干旱和盐胁迫浓度的加大，狗尾草幼苗的发芽率逐渐降低，长势越来越弱。

a1～e1 的甘露醇浓度梯度分别为0、100、200、300、400 mmol/L;a2～e2 的氯化钠浓度梯度分别为0、40、80、120、160 mmol/L。

Mannitol concentration gradients of a1–e1 were 0， 100， 200， 300 and 400 mmol/L， respectively. NaCl concentration gradients of a2–e2 were 0， 40， 80， 120 and 160 mmol/L， respectively.

2.2  肌动蛋白基因actin的PCR产物电泳检测与产物特异性、通用性验证

用狗尾草8个肌动蛋白基因，根据各自的引物（表1）分别进行荧光定量PCR验证，PCR扩增片段电泳分析如图2所示，从图4中可以看出，5～8号泳道条带单一且清晰，并且片段大小与预期一致。从电泳结果可以看出5～8号泳道对应的基因更适宜做荧光定量的内标基因。

从狗尾草8个肌动蛋白基因实时荧光定量PCR扩增曲线（图3）中可以看出，4、5和7号泳道对应的基因Ct值较低，所谓Ct值，就是最先

出现超过阈值信号的循环数，或者说是到了第几个循环才出现超过阈值的信号。C代表的是cycle（循环数目），t代表的是threshold（阈值）。所以表达量越少的话，需要越多的循环才能扩增出来。也就是Ct值越高。因此4，5和7号泳道对应的基因更适宜做荧光定量的内标基因。

从狗尾草8个肌动蛋白基因实时荧光定量PCR的溶解曲线（图4）中可以看出，1、3、4、6、7、8号基因对应的溶解曲线均为单峰，说明其对应引物的特异性强。其中峰值高则说明PCR扩增效率好，从图4中可以看出，7号基因（Sevir.9G 114100）对应的溶解曲线峰值单一，曲线平滑且峰值最高。

綜上所述，登录号Sevir.9G114100对应的actin基因是8个actin基因中最合适的内标基因。为了进一步验证该基因在狗尾草响应不同干旱及盐胁迫时的表达稳定性，做了该基因在9个不同处理条件下的分析检测。

用肌动蛋白基因actin（Sevir.9G114100）的PCR引物对9个不同处理条件下的狗尾草进行PCR检测，结果发现，如图5A所示，肌动蛋白基因actin的引物在PCR扩增时只扩增出一个条带，并且在不同处理条件下的狗尾草均能扩增出同一条带，大小为315 bp，与预期PCR片段长度一致，符合基因组内标基因特异性和通用性原则。转录组测序（RNA-seq）结果如图5B所示，Sevir.9G114100基因在9个不同处理条件下的TPM（Transcript Per Million）值在5%水平上没有显著差异，符合作为内标基因在各个处理阶段表达水平保持基本一致的标准。

对实时荧光定量 PCR 溶解曲线的分析实质上是产物的特异性分析。如果溶解曲线为单峰说明引物的特异性强，峰值高说明PCR扩增效率好。肌动蛋白基因actin（Sevir.9G114100）在响应不同程度干旱及盐胁迫时的实时荧光定量 PCR 溶解曲线均为单峰（图6），且与其他7个actin（图4）相比峰值均较高，说明引物特异性强，PCR扩增效率好。

M：DNA分子标准DL2000;泳道1～9依次为：未作任何处理、100 mmol/L甘露醇处理、200 mmol/L甘露醇处理、300 mmol/L甘露醇处理、400 mmol/L甘露醇处理、40 mmol/L氯化钠处理、80 mmol/L 氯化钠处理、120 mmol/L 氯化钠处理、160 mmol/L 氯化钠处理。图B中标有相同小写字母者表示组间差异不显著（P>0.05）。

M： DL2000 marker; The corresponding cDNA template for 1–9 was followed by untreated Setaria viridis， 100 mmol/L mannitol-treated， 200 mmol/L mannitol-treated， 300 mmol/L mannitol-treated， 400 mmol/L mannitol-treated， 40 mmol/L sodium chloride-treated， 80 mmol/L sodium chloride-treated， 120 mmol/L sodium chloride-treated and 160 mmol/L sodium chloride-treated Setaria viridis. The data in the figure B with the same lowercase letters indicate no significant difference between groups （P>0.05）.

从上述实时荧光定量PCR引物扩增条带、实时荧光定量PCR溶解曲线分析结果可以看出，肌动蛋白基因actin（Sevir.9G114100）具备作为狗尾草基因组响应不同干旱及盐胁迫条件下的基因表达内标基因的特点，利用本研究所述PCR引物序列及扩增方法，可以实现对狗尾草响应不同干旱及盐胁迫条件下目的基因的相对表达量的检测。

2.3  狗尾草响应不同干旱及盐胁迫时RNA- seq筛选基因结果验证

为了验证所选内标基因actin（Sevir.9G 114100）的实用性，我们对狗尾草响应不同干旱及盐胁迫时的RNA-Seq结果所筛选到的目的基因任选2个Sevir.1G249200和Sevir.J003400进行9种不同处理条件下的实时荧光定量PCR验证，结果如图7A、图7B所示，图7A和图7B代表通

过RNA-Seq筛选的需要验证的目的基因，引物如表1所示。验证的结果与RNA-Seq结果图7C和图7D保持一致。证明所选的actin内标基因适用于狗尾草响应不同干旱及盐胁迫时的基因表达验证工作。

1～9对应的cDNA模板依次为未作任何处理、100 mmol/L甘露醇处理、200 mmol/L甘露醇处理、300 mmol/L甘露醇处理、400 mmol/L 甘露醇处理、40 mmol/L氯化钠处理、80 mmol/L氯化钠处理、120 mmol/L氯化钠处理、160 mmol/L氯化钠处理的狗尾草;A和B分别代表基因Sevir.1G249200和Sevir.J003400在9种不同处理条件下的实时荧光定量PCR验证;C和D分别代表基因Sevir.1G249200和Sevir.J003400在9种不同处理条件下的转录组数据验证。

The corresponding cDNA template for 1–9 was followed by untreated Setaria viridis， 100 mmol/L mannitol-treated， 200 mmol/L mannitol-treated， 300 mmol/L mannitol-treated， 400 mmol/L mannitol-treated， 40 mmol/L sodium chloride-treated， 80 mmol/L sodium chloride-treated， 120 mmol/L sodium chloride-treated， 160 mmol/L sodium chloride-treated Setaria viridis; A and B represent the real-time PCR of Sevir.1G249200 and Sevir.J003400 under 9 different treatment conditions; C and D represent the transcriptome data validation of Sevir.1G249200 and Sevir.J003400， respectively， in 9 different treatment conditions.

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