荷叶碱在青霉菌培养基中抑菌效果的研究

李帆

（安庆医药高等专科学校，安徽安庆 246052）

在高校微生物实验教学中，菌种污染是一个普遍存在的现象，一直困扰着教师和科研工作者，严重影响了教学效果。选择含有抗菌药物的培养基可以有效地抑制杂菌的生长[1]。荷叶碱（Nuciferine，NF）系从荷叶中提取的一种阿朴啡类生物碱，其为荷叶的主要活性成分之一，Li[2]等通过实验发现，荷叶碱能够显著抑制细菌和酵母菌的繁殖和增长，对霉菌的抑制作用较弱，这主要是因为荷叶碱抑制了酵母和细菌的有丝分裂，但霉菌除了进行无性繁殖外还进行有性繁殖，因此对其生长繁殖的抑制作用不明显。故本实验通过药敏试验检验不同浓度的荷叶碱营养琼脂培养基对青霉菌和实验室环境细菌的抑菌效果，为制备具有抑菌效果的青霉菌培养基提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

青霉菌由合肥师范学院微生物实验室分离保存；大肠杆菌由本实验室从土壤中分离保存；枯草芽胞杆菌（ATCC6633，南京便诊生物科技有限公司）；营养琼脂培养基（杭州微生物试剂有限公司）；哥伦比亚血琼脂培养基（上海柯玛嘉生物科技有限公司）；荷叶碱（分析纯，上海源叶生物科技有限公司）；定性滤纸（中速，泰州市滤纸厂）；电热恒温培养箱DNP型（上海精宏实验设备有限公司）；高压蒸汽灭菌器YX-280D+（合肥市华泰医疗设备有限公司）；紫外灯2537A型（江苏申星光电医疗器械有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 分离、纯化、鉴定污染青霉菌培养基的细菌

青霉菌培养过程中可能污染培养基的细菌主要来源于实验室教学用的其他菌种和实验室环境杂菌。其中，实验室环境杂菌主要来源于空气、实验人员包括教师和学生的手指皮肤以及实验室桌面；而本实验室教学用菌种主要有青霉菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。实验室环境杂菌的标本采集方法如下：采用空气沉降法收集实验室空气标本；随机采集安庆医药高等专科学校护理、药学、临床3个不同专业10个班级20名同学和所有授课教师共6名的手指皮肤样本，接种于血平板；实验桌面标本采用无菌棉拭子法。所有标本置37 ℃恒温箱中培育24 h，选择优势菌株经形态结构、16S rDNA鉴定确定其分类地位。

1.2.2 药敏试验

（1）荷叶碱抗菌药纸片制作。将定性滤纸用打孔机打成6 mm直径的圆形小纸片50片，分装在2支清洁干燥的小试管中，高压蒸汽灭菌后，置于恒温培养箱中45 ℃干燥。在小试管内加入浓度为7 U/L荷叶碱药液0.25 mL，小心翻动纸片，使各纸片充分浸透药液。同时在瓶口上记录药物名称，放恒温培养箱中45 ℃干燥后即密盖，置冰箱冷冻室存放备用，有效期6个月。（注：1U（万单位）=10mg）

（2）药敏试验（纸片法）。将青霉菌、大肠杆菌、枯草芽胞杆菌和实验室环境杂菌密集划线法接种于营养琼脂培养基中，将自制荷叶碱抗菌药物纸片贴于平板中央，青霉菌28 ℃培养48 h，细菌37 ℃培养24 h后，记录抑菌圈直径，检测其对荷叶碱的药物敏感度。

1.2.3 荷叶碱抑菌浓度

配制每升含1 U、3 U、5 U、7 U、9 U、11 U、13 U、15 U、17 U、19 U和21 U不同浓度荷叶碱的营养琼脂培养基，制成平板。将青霉菌和可能污染青霉菌培养基的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和实验室环境杂菌分别接种于平板上，青霉菌28 ℃培养48 h，细菌37 ℃培养24 h后观察记录生长情况。根据结果分析青霉菌耐药，细菌敏感的最低荷叶碱浓度。

2 结果与分析

2.1 实验室环境菌种鉴定

空气、手指皮肤和实验桌面标本经37 ℃恒温箱中培育24 h后，得到3株优势菌株，分别命名为B1、B2、B3。（1）菌落形态（图1）。B1：白色、圆形凸起、边缘整齐、表面光滑、湿润、不透明的菌落；B2：白色、圆形凸起、边缘整齐、表面粗糙、湿润、不透明的菌落，有草绿色溶血环；B3：白色、圆形凸起、边缘整齐、表面光滑、湿润、不透明的菌落，有透明溶血环。（2）革兰染色（图2）。B1是G+球菌，B2是G+杆菌，B3是G+球菌。经16S rDNA鉴定确定其分类地位，见表1。由于本实验室教学常用的菌种为青霉菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌，因此，实验教学中可能污染青霉菌菌种的杂菌主要5种，分别是大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、科氏/孔氏葡萄球菌、高地芽孢杆菌和表皮葡萄球菌。

图1 实验室环境菌种菌落形态

图2 实验室环境菌种革兰染色

2.2 药敏试验

药敏试验的结果（表2）表明，青霉菌对荷叶碱耐药，大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、科氏/孔氏葡萄球菌、高地芽孢杆菌和表皮葡萄球菌均对荷叶碱敏感。荷叶碱可制成药品[3]，充分发挥其杀毒、灭菌、降血压、止痉挛等作用。因此，可将荷叶碱作为本实验室青霉菌营养琼脂培养基中的抑菌药物。

2.3 荷叶碱最低抑菌浓度

将青霉菌、大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、科氏/孔氏葡萄球菌、高地芽孢杆菌和表皮葡萄球菌分别接种于不同浓度荷叶碱的营养琼脂培养基上，青霉菌28 ℃培养48 h，细菌37 ℃培养24 h后，观察生长情况，结果见表3。由表3可知，培养基中荷叶碱浓度为1～21 U/L时，青霉菌均能生长良好，说明荷叶碱对青霉菌没有抑菌效果；培养基中荷叶碱浓度高于7 U/L时大肠杆菌不能生长；荷叶碱浓度高于13 U/L时枯草芽孢杆菌不能生长；荷叶碱浓度高于9 U/L时科氏/孔氏葡萄球菌不能生长；荷叶碱浓度高于7 U/L时高地芽孢杆菌不能生长；荷叶碱浓度高于11 U/L时表皮葡萄球菌不能生长。因此，培养基中荷叶碱浓度高于为13 U/L时大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、科氏/孔氏葡萄球菌、高地芽孢杆菌和表皮葡萄球菌均不能生长，而青霉菌生长良好，青霉菌培养基中荷叶碱最低抑菌浓度是13 U/L。

表1 实验室环境优势菌种鉴定结果

表2 药敏试验结果

表3 不同浓度的荷叶碱培养基中菌种生长情况

3 结论

本研究通过药敏试验结果证明，用浓度为13 U/L的荷叶碱营养琼脂培养基培养青霉菌，能够有效抑制大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、科氏/孔氏葡萄球菌、高地芽孢杆菌和表皮葡萄球菌生长。我国的荷叶资源丰富[4]，价格低廉且易得，故对荷叶碱在培养基中的抑菌效果研究具有很大的现实意义。