解磷菌培养的代谢产物初步研究

李文谦，卢康，茅燕勇，陈大兵

（1.淮阴工学院，江苏淮安223003；2.淮安市三商农业科技有限公司，江苏淮安223300）

磷是植物生长不可或缺的营养物质之一，对于植物的代谢生长起着重要的促进作用[1]。但是，土壤中能被植物直接吸收促进其生长的磷的含量非常低，且植物能吸收利用的有效磷量很少，不到土壤中所有磷的1%[2]。解磷微生物能够将土壤中不能吸收利用的磷转化为可吸收利用的磷，提高土壤中植物可利用磷的含量。另外，它可使土壤中的一些微量元素成为可促进植物生长的形式，如铁、锌等[3-5]。解磷微生物能转化可溶磷的原因，主要是其在代谢过程中产生了多种有机酸，如草酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸和琥珀酸等，与此同时，有机酸和一些微量元素螯合，使得营养物质pH下降，酸度升高，磷酸盐得以溶解[6-7]。另外，解磷微生物代谢过程中分泌的磷酸酶、蛋白质、多糖等，也可能与解磷微生物的解磷效果有关[8]。本文采用在淮安果园土壤中筛选获得的高效解磷菌，对其发酵培养，测定发酵液中的有机酸浓度、磷酸酶活性、蛋白质含量、多糖含量等，初步研究该解磷菌的代谢产物。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

枯草芽孢杆菌，为实验室筛选解磷菌。

1.1.2 培养基

活化培养基（LB培养基）：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，加入去离子水1L，pH 7.0。

发酵培养基：10g，硫酸铵5g，氯化钠0.3g，氯化钾0.3g，七水合硫酸镁0.3g，七水合硫酸亚铁0.03g，一水合硫酸锰0.03g，磷酸二氢钾（磷酸三钙或卵磷脂等）2g，定容至1000mL，，pH7.0～7.5。

1.2 方法

1.2.1 有机酸含量的测定

用量筒准确量取10mL经过10000r/min离心10min的发酵液，转移到100mL的容量瓶中，用去离子水定容、摇匀，待用。准确吸取稀释样液20mL于150mL三角瓶中，加入1%的酚酞2滴，用装有0.05mol/L的氢氧化钠的碱式滴定管滴定，滴定直至溶液的颜色刚刚显粉色，30s内不褪色就完成滴定，记下滴定所用的氢氧化钠的体积。有机酸含量(%)=kcV/10×100%，式中，c为NaOH浓度 (mol/L)，k为换算系数，取0.064，V为消耗NaOH液量(mL)。3次重复，取平均值。

1.2.2 磷酸酶活性的测定

标准曲线的制作:分别吸取标准对硝基酚溶液0、l、2、3、4、5ml于试管中，定容至5ml。加1mL的0.5mol/L的氯化钙溶液和4mL的0.5mol/L氢氧化钠溶液,420nm比色。绘制标准曲线，计算标准曲线的回归方程及R2值：Y=0.6688X-0.0008 (R2=0.9997)。

用移液枪吸取1mL经过10000r/min离心10min的发酵上清液于干净试管中，加入4mL MUB(检测酸性磷酸酶时所用的MUB试剂的pH为6.5，检测碱性磷酸酶时所用的MUB试剂的pH为11），再加用相同pH的缓冲液配制成的1mL对硝基苯磷酸二钠溶液，振荡几秒钟混匀，塞住瓶塞，在恒温培养箱中37℃培养1 h，取出打开瓶塞，分别加入1mL的0.5mol/L的氯化钙溶液和4mL的0.5mol/L氢氧化钠溶液，震荡后用滤纸过滤悬液，将澄清滤液在420nm处比色，。由标准曲线换算得相应的磷酸酶活性。

1.2.3 多糖、蛋白质含量测定

分别采用硫酸-苯酚法、考马斯亮蓝法测定发酵液中的多糖、蛋白质含量[9-10]。

用分析天平准确称取标准葡萄糖20mg于500ml容量瓶中，加去离子水定容至刻度，摇匀。分别吸取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 及 0.9ml该溶液于比色管中，各以去离子水补至1.0ml，然后各加入6%的苯酚0.5ml及浓硫酸2.5ml，摇匀冷却，室温放置20min后，于490nm处测吸光度值以1ml去离子水为空白组按上述操作调零。以多糖微克数为横坐标，纵坐标为吸光度值，绘制标准曲线。计算标准曲线的回归方程及R2值：Y=10.029X-0.0095(R2=0.994)。将发酵液离心取0.2ml上清液，按上述标准曲线中的操作方法测定，以上述空白组调零，在490nm处测吸光度值，然后按回归方程计算待测溶液中的多糖浓度。

取6支比色管分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml的0.1mg/ml的标准蛋白质溶液，再各用去离子水补齐至1ml,后分别加入5ml考马斯亮蓝溶液，混合均匀，静置5min后用1cm光径比色杯在595nm下比色，一小时内完成比色。横坐标为蛋白质浓度，以吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。计算标准曲线的回归方程及R2值：Y=4.9543X+0.006(R2=0.999)。发酵液离心1ml上清液，加入5ml考马斯亮蓝溶液，摇匀静置5min，以上述空白管调零，于595nm处比色，由标准曲线计算发酵液中的蛋白质浓度。

1.2.4 可溶性磷含量的测定

用移液管分别准确吸取5mg/L的磷标准溶液0、2、4、6、8、10ml于洁净的1-6号50ml容量瓶中，用去离子水补齐至10ml，再加入二硝基酚指示剂2-3滴，并用100g/L氢氧化钠溶液调节至溶液刚呈微黄色，用移液枪准确加入5ml钼锑钪显色剂，摇匀，加去离子水定容，于室温15℃以上，放置30min。在波长700nm处，测定其吸光度，以吸光度值为纵坐标，磷浓度(mg/L)为横坐标，绘制标准曲线。计算标准曲线的回归方程及R2值：Y=0.4956X+0.0027(R2=0.999)。

将待测发酵液经10000r/min离心10min，取2mL上清液移至50mL容量瓶中，用水稀释至总体积约3/5处，滴加二硝基酚指示剂1～2滴，并用100g/L氢氧化钠溶液调节至溶液刚呈微黄色，用移液枪准确加入5mL钼锑钪显色剂，摇匀，加去离子水定容，室温15℃以上，放置30min。显色的发酵液进行比色测定，读取吸光度值，再由回归方程计算得相应的含磷量[11]。

2 结果与分析

2.1 不同磷源发酵液中有机酸浓度的变化

有机酸是一类酸性有机化合物，能够解离出游离的氢离子，氢离子和磷酸根结合形成可溶性磷酸盐，同时，有机酸根离子能够与金属离子结合从而释放无机磷。不同磷源发酵液中有机酸浓度的变化如图1所示，3种磷源的发酵液中的有机酸浓度都随发酵时间延长而出现一定程度的上升，但空白无磷源的发酵液中的有机酸含量远小于有磷源的发酵液中的有机酸含量。以磷酸钙为唯一磷源时的发酵液中有机酸含量最高，达33.1mg/L。

图1 不同时间段磷源的发酵液中有机酸浓度

2.2 不同磷源发酵液中磷酸酶活性的变化

酸性磷酸酶能够从不同的有机磷底物上水解磷酸基团，释放出无机磷供植物吸收利用。碱性磷酸酶可以催化几乎所有的磷酸单酯的水解反应，生成无机磷酸和相应的醇、酚、糖等，促进植物生长繁殖。不同磷源发酵液中磷酸酶活性的变化如图2和图3所示，随着发酵的进行，不同磷源中的磷酸酶活性均呈现缓慢下降趋势。无磷源的发酵液中磷酸酶活性较低，有磷源的发酵液中的磷酸酶活性远高于无磷状态，其中以磷酸二氢钾和磷酸钙为磷源时的发酵液中磷酸酶活性相差不大，但以卵磷脂为唯一磷源时的磷酸酶活性则明显高于两者。这说明磷酸酶的活性在发酵初期比较高，随着发酵的时间的增长，磷酸酶活性缓慢下降，因此磷酸酶是枯草芽孢杆菌的解磷物质，与解磷效果密切相关，但主要作用在解磷前期。

2.3 不同磷源发酵液中多糖含量的变化

由图4可知，不同磷源条件下，枯草芽孢杆菌均产生一定浓度的多糖，发酵液中多糖含量呈先下降后上升的趋势。其中以卵磷脂为唯一磷源时的多糖含量最高，达54.2mg/L。枯草芽孢杆菌溶解有机难溶磷产生的多糖高于溶解无机难溶磷。

2.4 不同磷源发酵液中蛋白质浓度的变化

添加不同种类磷源条件下培养枯草芽孢杆菌一定时间，测定其蛋白质浓度，结果见图5。由图5可知，在3种不同磷源条件下，以卵磷脂为唯一磷源时的蛋白质浓度最高，为51mg/L，而空白不含磷源的发酵液中的蛋白质含量极低，仅有10.1mg/L。这就表明蛋白质可能也是枯草芽孢杆菌溶解难溶磷的重要代谢产物之一，影响着枯草芽孢杆菌的解磷效果。

图2 不同时间段磷源发酵液中酸性磷酸酶活性

图3 不同时间段磷源发酵液中碱性磷酸酶活性

图4 不同时间段磷源发酵液中多糖含量

2.5 不同磷源发酵液中磷含量的变化

在不同磷源条件下发酵液中可溶性磷含量如图6所示。由图6可见，发酵液中磷含量都呈上升趋势，空白无磷的发酵液中可溶磷含量最低，仅达到0.041mg/L，以卵磷脂为唯一磷源的可溶磷含量最高，达0.956mg/L。说明枯草芽孢杆菌对不同形态的难溶磷的溶解能力存在差异。

3 结论

在外界磷源的诱导下，解磷菌在代谢过程中产生有机酸而发挥其溶解外界磷元素的能力。本文对不添加磷源、磷酸二氢钾、碳酸钙和卵磷脂4种不同培养基中解磷菌的代谢产物进行了比较分析，发酵液中有机酸含量最高为33.1mg/L，酸性磷酸酶含量最高达242.6μmol/(L·h)，多糖含量最高达54.2mg/L，蛋白质含量最高达51mg/L，磷含量最高达0.956mg/L。

图5 不同时间段磷源发酵液中蛋白质浓度

图6 不同时间段磷源发酵液中磷含量