毛泡桐内生真菌的分离、拮抗细菌菌株的筛选和鉴定

张 健， 姜素平， 蒋继宏， 鞠秀云

(江苏师范大学 生命科学学院 江苏省药用植物生物技术重点实验室，江苏 徐州 221116)

自1928年青霉素被发现以来，抗生素药物得到了迅速、全面的发展，已成为现代医学的一个支柱[1]。但随着抗生素的长期大量使用，越来越多的细菌产生了耐药性，因此研发新的抗生素迫在眉睫[2]。内生真菌是指在其生活史的一定阶段或全部阶段，生活于健康植物各种组织和器官细胞间隙或细胞内的真菌，在与宿主植物协同进化过程中能产生多种独特的次生代谢产物[3]。自1993年Stiere等[4]报道从短叶红豆杉中分离到能产生紫杉醇的内生真菌以来，人们已从药用植物中分离获得一些能够产生多种活性物质的内生真菌。如：姚裕群等[5]从越南槐中分离到1株疣孢漆斑菌，其代谢产物具有强的抗白念珠菌活性； Pinheiro等[6]从紫荆花中分离到1株内生真菌嘴突脐孢(Exserohilumrostratum)，其甲醇提取物对所测试的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌等表现出较好的活性，显示出广泛的抗菌谱。毛泡桐是玄参科泡桐属植物，泡桐属共有7个种，分别是白花泡桐(Paulowniafortunei(Seem.) Hemsl.)、毛泡桐(Paulowniatomentosa(Thunb.)Steud.)、兰考泡桐(PaulowniaelongataS.Y.Hu)、椒叶泡桐(PaulowniacatalpifoliaGong Tong)、台湾泡桐(PaulowniakawakamiiIto)、川泡桐(PaulowniafargesiiFranch.)和南方泡桐(PaulowniaaustralisGong Tong)[7]。泡桐属植物不仅是一种优质木材，在工农业方面有着广泛用途，同时还是一种常用的中草药，其花、叶、皮、根、果古时就有药用记载，如《本草纲目》记述:“桐叶主恶蚀疮著阴，皮主五痔，杀三虫。花主傅猪疮，消肿生发”[8]。对泡桐属植物的化学成分研究始于20世纪30年代，人们先后分离得到糖苷类化合物[9]、木脂素类、苯丙素类、环烯醚萜类、黄酮类、倍半萜类、三萜类等，其中许多化合物被证明具有一定的抑菌[10]、消炎[11]、抗衰老[12-13]和抗肿瘤[14]等生物活性。但有关泡桐属植物内生真菌的研究鲜有报道，罗江华等[15]对白花泡桐的内生真菌进行分离，仅得到19株内生真菌；而有关毛泡桐内生真菌的研究未见报道。本研究对河南毛泡桐进行内生真菌的分离、鉴定及其抑制细菌活性的筛选，为寻找新型药物提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物样本 毛泡桐根、茎和叶于2016年7月采自河南郑州和新乡两个地区。

1.1.2 指示菌 大肠埃希菌(Escherichiacoli)、枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、青枯假单胞菌(Pseudomonassolanacearum)均由江苏省药食植物生物技术重点实验室提供及保存。

1.1.3 培养基[16]分离培养基：马铃薯葡萄糖固体培养基、察氏培养基、马丁培养基；纯化培养基：马铃薯葡萄固体培养基(PDA培养基)；发酵培养基：马铃薯葡萄糖液体培养基；细菌培养基：LB培养基。

1.1.4 主要试剂 ITS4和ITS5由上海俊捷生物工程有限公司合成，rDNA-ITS的扩增试剂由上海生工生物股份有限公司生产，青霉素钾(400万单位)由合肥中龙神力动物药业有限公司生产，乙酸乙酯、丙酮等有机试剂为国产分析纯。

1.1.5 仪器及设备 荧光细胞成像显微镜(742BR1815型)、电泳仪(041BR型)、凝胶成像仪(Universal HoodⅡ型)，均为美国BIO-RAD公司；PCR仪(Varies，美国Applied Biosystems公司)；旋转蒸发仪(N-1100D-W，上海申生科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 毛泡桐内生真菌的分离和纯化 用自来水将采集的新鲜无病症的毛泡桐根、茎和叶表面污垢冲洗干净，自然风干，分别切成约1.5 cm的小段，无菌条件下进行表面消毒：无菌水冲洗3次、5%次氯酸钠溶液消毒(叶3 min，茎4 min，根5 min)、2.5%硫代硫酸钠荡洗1 min、无菌水冲洗3次、75%酒精浸泡2 min、无菌水洗涤3次。将表面消毒后的样本切成0.3 cm×0.3 cm大小的块状，接种于3种分离培养基上，28 ℃培养箱中培养；同时将上述表面灭菌时最后一次冲洗的无菌水取200 μL涂布于分离培养基上，相同条件下培养，检查表面灭菌是否干净。3～10 d后，挑取形态不同的菌丝或菌落移接到PDA培养基上进行纯化，保存纯化后的菌株，备用。

1.2.2 抗细菌活性菌株初筛 采用琼脂块法对分得的内生真菌进行抑菌活性的初选。具体步骤：用打孔器从PDA平板生长的菌落上截取直径为6.0 mm的琼脂块，用无菌镊子将琼脂块放置于涂有指示菌(约1×108cfu/mL)的PDA平板上，28 ℃培养2 d，观察及测量抑菌圈直径。

1.2.3 抗细菌活性菌株复筛 采用滤纸片扩散法对活性菌株进行复筛。将初筛得到的活性菌株接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中，28 ℃、160 r/min培养7 d。所得发酵产物经过滤分为发酵液和菌丝体两部分，发酵液用乙酸乙酯萃取，萃取液减压浓缩得浸膏E(乙酸乙酯相)；菌丝体用丙酮浸泡提取，减压浓缩得浸膏A(丙酮相)。吸取细菌菌液(约1×108cfu/mL)100 μL涂布于LB平板上，在适当位置贴上己灭菌的滤纸片(Φ=6 mm)。以50%丙酮为溶剂，将浸膏E和浸膏A分别配成10 mg/mL溶液，用500 μg/mL的青霉素钾溶液做阳性对照，50%丙酮作阴性对照。分别吸取20 μL上述溶液滴于滤纸片上，每个样品重复3次。37 ℃恒温培养18～24 h后观察，测抑菌圈大小。

1.2.4 抗细菌活性真菌的鉴定 形态特征：采用插片法对复筛得到的活性菌株进行培养，观察其菌落、菌丝和孢子特征，参照《真菌鉴定手册》进行形态描述[17]。活性菌株ITS序列测定及系统发育学分析：真菌DNA的提取采用微波法[18]，利用真菌通用引物ITS4(5′-TCCGCTTATTGATATG C-3′)和ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAG-G-3′)经PCR从真菌基因组DNA中扩增出rRNA基因的内部转录间隔区(ITSs)。程序反应条件：95 ℃ 3 min；95 ℃、0.5 min，58 ℃ 1 min，72 ℃1 min，30个循环；72 ℃ 5 min。PCR产物由上海生工生物技术服务有限公司进行纯化和测序。将测得的ITS序列在NCBI上进行序列比对，根据比对结果选择相似性较高的菌株序列，利用MEGA5.01软件以Neighbor-Joining计算方式生成系统发育进化树。

2 结果与分析

2.1 抑制细菌活性初筛

从毛泡桐的根、茎、叶中共分得46株菌落特征有差异的内生真菌，其中从根中分得3株，茎中分得18株，叶中分得25株。利用琼脂块法对46株内生真菌进行抑制细菌活性的筛选，结果表明共有9株内生真菌对至少1株指示菌具有抑制活性，其中KLBMP-Pt630、KLBMP-Pt675和KLBMP-Pt686对3株及以上指示菌具有很好地抑制作用(表1)。

表1 抑制细菌的内生真菌统计Table 1 Statistics of endophytic fungi with antibacterial capabilities

2.2 抑制细菌活性复筛

选取抗细菌活性较好的菌株KLBMP-Pt630、KLBMP-Pt675和KLBMP-Pt686，利用滤纸片扩散法测定其发酵液乙酸乙酯相和菌丝体丙酮相对4种指示菌的抑制作用。结果显示：菌株KLBMP-Pt630发酵液乙酸乙酯相对枯草芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌和青枯假单胞菌的抑菌圈平均直径分别为13、12和11 mm，菌株KLBMP-Pt675发酵液乙酸乙酯相对枯草芽胞杆菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和青枯假单胞菌的抑菌圈平均直径分别为11、15、14和11 mm，菌株KLBMP-Pt686发酵液乙酸乙酯相对枯草芽胞杆菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和青枯假单胞菌的抑菌圈直径分别为21、11和23和20 mm。同等浓度下3株菌的菌丝体丙酮提取物对4种指示菌无明显抑制作用。阳性对照在此浓度下对大肠埃希菌没有显示出抑制作用，对枯草芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌和青枯假单胞菌抑菌圈平均直径为39、12和24 mm。阴性对照对4株菌均无抑制作用，如图1所示。

菌株KLBMP-Pt630的发酵液乙酸乙酯相对金黄色葡萄球菌的活性与阳性对照相同，对枯草芽胞杆菌和青枯假单胞菌活性要弱于阳性对照，对大肠埃希菌没有作用；菌株KLBMP-Pt675和KLBMP-Pt686的发酵液乙酸乙酯相对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的活性大于阳性对照，对枯草芽胞杆菌和青枯假单胞菌的活性弱于阳性对照。内生真菌KLBMP-Pt675和KLBMP-Pt686对4株细菌均具有活性。

图1 3株高活性内生真菌的发酵液乙酸乙酯相对4种指示菌的抑制作用Fig.1 Antibacterial capabilities of metabolites from three strains endophytic fungi

2.3 菌株KLBMP-Pt630、KLBMP-Pt675、KLBMP-Pt686的形态特征

菌株KLBMP-Pt630菌落特征为菌丝繁密呈绒状，颜色幼时为白色后逐渐变为红褐色，在PDA上产玫瑰红色素；菌丝具有明显的分隔，分生孢子座中的大型分生孢子呈镰刀状，腹部弯曲，顶细胞渐尖，具有2～5个隔膜(图2中A1和A2)。菌株KLBMP-Pt675菌落质地丝绒状，菌丝体白色，分生孢子结构呈暗蓝绿色；显微观察其分生孢子头为棒形，壁较薄，光滑无色，顶囊由孢梗茎顶端逐渐膨大成为棍棒形，产孢结构单层，瓶梗密集着生于顶囊的全部表面(图2中B1和B2)。菌株KLBMP-Pt686菌落颜色为淡黄色，菌落稠密，呈肉质状，色泽鲜艳；菌丝呈丝状，分生孢子梗轮生，顶端着分生孢子，分生孢子呈梭型(图2中C1和C2)。基于形态学特征比较，菌株KLBMP-Pt630初步鉴定为镰刀菌属、菌株KLBMP-Pt675初步鉴定为曲霉属、菌株KLBMP-Pt686初步鉴定为肉座菌。

图2 菌株KLBMP-Pt630、KLBMP-Pt675和KLBMP-Pt686的形态特征Fig.2 Morphological characteristics of strains KLBMP-Pt630, KLBMP-Pt675 and KLBMP-Pt686

2.4 菌株KLBMP-Pt630、KLBMP-Pt675、KLBMP-Pt686的ITS序列分析

利用引物ITS4和ITS5经PCR分别扩增出菌株KLBMP-Pt630、KLBMP-Pt675和KLBMP-Pt686的ITS序列进行测序分析，长度分别为568、597和623 bp，参考GenBank比对结果，利用MEGA 5.01软件以Neighbor-Joining计算方式生成系统发育进化树，如图3所示。KLBMP-Pt630 与Fusariumtricinctum在同一个分支内，序列相似性为99%；KLBMP-Pt675被聚类在Aspergillus组中，与Aspergillusclavatus相似性为99%；KLBMP-Pt686与Hypocrealessp. E14023c相似性为99%。结合3株菌的形态学观察结果，菌株KLBMP-Pt630初步鉴定为三线镰刀菌(Fusariumtricinctum)，菌株KLBMP-Pt675鉴定为棒曲霉(Aspergillusclavatus)，菌株KLBMP-Pt686鉴定为肉座菌目真菌(Hypocrealessp.)。

图3 菌株KLBMP-Pt630、KLBMP-Pt675和KLBMP-Pt686的ITS系统发育树Fig.3 Phylogenic tree of ITS sequences of strains KLBMP-Pt630, KLBMP-Pt675 and KLBMP-Pt686

3 讨 论

植物内生菌作为一种新型微生物资源，具有种类繁多、蕴藏量大的特点。研究表明，从植物内生真菌中可发现结构新颖且具有较高活性的次生代谢产物，其中的一些化合物具有很强的抗菌能力，具有开发成新的抗菌药物的潜力[19]。目前为止，许多研究者已从不同的植物内生真菌中分离得到大量具有抗菌活性的新化合物。Zhou等[20]从红树林植物木榄Bruguieragymnorrhiza中分到1株青霉菌Penicilliumsp. GD6，从其代谢产物中分离得到1个新双吡咯烷类生物碱，对金黄色葡萄球菌具有极强的抑菌活性。Tejesvi等[21]从杜鹃类灌木中分离出1株三线镰刀菌(Fusariumtricinctum)，能够产生1种抗菌肽，对白色念珠菌和葡萄球菌具有很好地抑制作用。本研究选取2株典型的人类病原细菌、1株植物病原细菌和1株枯草芽胞杆菌作为指示菌，对分离自毛泡桐叶、茎、根中的46株内生真菌进行抑制细菌活性筛选，得到3株具有广谱抑菌的内生真菌，分别记为KLBMP-Pt630、 KLBMP-Pt675和KLBMP-Pt686。其中菌株KLBMP-Pt686的乙酸乙酯提取物活性极强，尤其是对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的抑菌活性，比检测时用的500 μg/mL青霉素钾活性要高。菌种鉴定未能鉴定到种，序列比对时对比的菌株Hypocrealessp. E14023c(KF466233)也没有进行过相关研究。因此，对菌株KLBMP-Pt686的进一步研究，可能得到一些新的抗菌物质。