银柴胡不同材料总DNA提取方法的筛选

李 军， 郝彩琴， 张 燃， 冷晓红

(宁夏职业技术学院，宁夏银川 750021

银柴胡(别称银胡、山菜根、牛肚根、沙参儿、白根子等)是石竹科繁缕属植物银柴胡(StellariadichotomaL. var.lanceolateBge.) 的干燥根[1]，味甘性寒，具有清虚热、除疳热的功效，临床用于阴虚发热、骨蒸劳热、小儿疳热等症[2]。银柴胡作为2015年版《中华人民共和国药典》收载的传统中药[3]，在临床上的应用比较广泛，尤其是将其作为主要成分的传统中成药乌鸡白凤丸，在临床上有很好的口啤[4]。

DNA条形码技术(DNA bar-coding)作为中药材物种鉴定研究中的新方法，是利用标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段对物种进行快速、准确的鉴定的技术[5]，且具有鉴定结果准确、可重复性良好、方法通用性强等优点。DNA条形码鉴定技术已经在冬虫夏草、枸杞、羌活、党参、天南星、锁阳等中药材及其混伪品的鉴定中取得了良好的效果[6]，并已被收录进2015年版《中华人民共和国药典》[3]。获取高质量的DNA是进行银柴胡DNA条形码研究的必要前提和关键环节。本研究以银柴胡叶片、鲜根和干根为材料，考察6种DNA提取方法，旨在寻找一种能够得到相对高产量、高纯度的适合于银柴胡总DNA提取的方法[7-8]，为后续银柴胡DNA条形码分子鉴定及分子生物学的深入研究提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料

银柴胡叶片和鲜根于2016年10月采自宁夏回族自治区吴忠市同心县预旺镇南关村，叶片和一部分根趁鲜放入 -70 ℃ 冰箱中冷冻，备用，另一部分根自然晾干。以上样品经宁夏大学李吉宁教授鉴定为石竹科繁缕属植物银柴胡(StellariadichotomaL. var.lanceolateBge.)的叶片及根。

1.2 仪器与试剂

My Cycler PCR仪、Bio Gel Doc XR+凝胶成像系统、Powerpac basic琼脂糖凝胶电泳仪，购自美国伯乐有限公司；Sigma1-14高速离心机，购自德国Sigma公司；Geno 2010高通量组织研磨机，购自美国SPEX SamplePrep公司；Q6000核酸蛋白检测仪，购自美国Quawell公司；TGL-16G型低温冷冻离心机，购自上海安亭科学仪器厂；Mini10k迷你离心机，购自珠海黑马医学仪器有限公司；SZ-1涡旋混合器，购自常州国宇仪器制造有限公司；HHSY21-Ni4-C恒温水浴锅，购自北京长源实验设备厂。

十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十二烷基硫酸钠(SDS)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、聚乙烯吡咯烷酮 40(PVP-40，纯度>95%)、三羟甲基氨基甲烷(Tris，纯 度>99.5%)。植物基因组DNA提取试剂盒、PCR所用dNTPs(10 mmol/L)、TaqDNA聚合酶(5 U/μL)、Mg2+(25 mmol/L)、10×PCR buffer、DL 2000 marker，均购自天根生化科技(北京)有限公司；ITS2和psbA-trnH引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；琼脂糖为西班牙琼脂糖Biowest Agarose；三氯甲烷、异戊醇、乙醇、异丙醇、无水乙醇、氯化钠、醋酸钠等为国产分析纯试剂。

1.3 DNA提取方法

以银柴胡的叶片、鲜根和干根为材料，分别采用2% CTAB法、4% CTAB法、SDS法、试剂盒法、高盐低pH值法和尿素法共6种方法提取3种材料的DNA。提取的DNA经紫外检测、琼脂糖凝胶电泳和PCR扩增确定最适方法。

1.3.1 2%CTAB法 取银柴胡叶片(长0.5～1.0 cm)、鲜根(长0.2～0.5 cm)和干根(长0.2～0.5 cm)，经70%乙醇擦洗表面后放入600 μL 2% CTAB缓冲液[2% CTAB、100 mmol/L Tris-HCl(pH值8.0)、20 mmol/L EDTA、1.4 mol/L NaCl、2%可溶性PVP]中，并加入2%β-巯基乙醇，再加2枚直径为 0.45 mm 的小钢珠，叶片和鲜根置于研磨仪上，以1 400次/min研磨4 min，干根以1 600次/min研磨6 min； 65 ℃水浴30～45 min，4 ℃、12 000 r/min离心 10 min；在上清液中加入等体积三氯甲烷、异戊醇(体积比为24 ∶1) 充分混匀，4 ℃、12 000 r/min 离心10 min；取上清液，重复以上步骤1～2次，直到界面清晰为止；在上清液中加入2～3倍体积的-20 ℃预冷的异丙醇，于-20 ℃静置30 min，4 ℃、12 000 r/min离心 20 min；沉淀用70%乙醇洗涤2次后，4 ℃、12 000 r/min离心 2 min，沉淀晾干后加入100 μL TE缓冲液[由三羟甲基氨基甲烷(Tris)和EDTA配制而成]溶解，-20 ℃保存备用。

1.3.2 4% CTAB法 具体步骤参考“1.3.1”节，提取液为4% CTAB缓冲液[2% CTAB、100 mmol/L Tris-HCl(pH值8.0)、20 mmol/L EDTA、1.4 mol/L NaCl、3%可溶性PVP、2%β-巯基乙醇]。

1.3.3 SDS法 具体步骤参考“1.3.1”节，提取液为SDS缓冲液[10% SDS、50 mmol/L Tris-HCl(pH值8.0)、100 mmol/L EDTA、1%可溶性PVP、2%β-巯基乙醇]。

1.3.4 试剂盒法 在材料中加入GP1缓冲液，参照 “1.3.1”节的方法研磨，采用植物基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)提取DNA，详细操作参照试剂盒说明书。

1.3.5 高盐低pH值法 根据文献[9]的操作步骤进行试验，材料处理方法同“1.3.1”节，提取缓冲液含0.1 mol/L NaAc、0.05 mol/L EDTA、0.5 mmol/L NaCl、3% PVP、3% SDS、1%β-巯基乙醇。

1.3.6 尿素法 在材料中加入尿素裂解液[7 mmol/L尿素、0.3 mol/L 氯化钠、0.034 mol/L十二烷基肌氨酸钠、50 mmol/L Tris-HCl(pH值8.0)、20 mmol/L EDTA(pH值 8.0)]，参照 “1.3.1”节的方法研磨，摇匀，65 ℃水浴20～30 min；12 000 r/min离心10 min，吸取上清液，将上清液移入另一新管中；加入等体积的三氯甲烷、异戊醇(体积比为 24 ∶1)溶液，振荡数次混匀，12 000 r/min离心10 min；重复上述步骤；在上清液中加入2/3体积的-20 ℃预冷的异丙醇，混匀，-20 ℃沉淀 30 min，12 000 r/min离心10 min；在沉淀中加入200 μL 70%乙醇洗涤2次，4 ℃、12 000 r/min离心2 min，沉淀晾干后加入100 μL TE溶解，-20 ℃保存备用。

1.4 DNA的质量检测

1.4.1 紫外检测 取2 μL采用6种方法提取的银柴胡叶片、鲜根及干根DNA溶液，用核酸蛋白检测仪分别测定260、280 nm处的吸光度。根据D260 nm/D280nm值判断DNA纯度，根据D260 nm计算DNA浓度。

1.4.2 琼脂糖凝胶电泳检测 取7 μL DNA母液加1 μL上样缓冲液，用Gelred进行染色，上样于1%琼脂糖凝胶，以DL 2000 marker为标准，在1×TAE的电泳缓冲液中进行水平板电泳，100 V恒电压，电泳约30 min，用凝胶成像系统进行拍照检测。

1.4.3 PCR扩增检测 以试剂盒法提取银柴胡叶片和鲜根DNA、高盐低pH值法提取干根所得DNA为模板，按照文献[9]中ITS2和psbA-trnH通用引物、25 μL反应体系和条件进行PCR扩增。扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，用Bio Gel DocTM XR+凝胶成像分析系统拍照、分析。

2 结果与分析

2.1 提取银柴胡总DNA的紫外检测

由表1可知，用试剂盒法、2% CTAB法、4% CTAB法提取得到的银柴胡叶片DNA的D260nm/D280 nm值均在1.8～2.0范围，表明这3种方法得到的DNA质量较好。试剂盒法提取的DNA浓度较高，高盐低pH值法提取的DNA浓度最低，且D260 nm/D280 nm值大于2.0，说明有酚类和糖类等的污染。SDS法与尿素法提取到的DNA的D260 nm/D280 nm值小于1.8，说明得到的DNA中存在蛋白质的污染。

表1 银柴胡药材叶片总 DNA 提取纯度及浓度

由表2可知，对于银柴胡鲜根DNA的提取，2% CTAB法、4% CTAB法和试剂盒法提取DNA的D260 nm/D280 nm值均在1.8～2.0标准范围内，表明其DNA纯度较高，其中试剂盒法提取的浓度最高；高盐低pH值法提取DNA的D260 nm/D280 nm值在2.0以上，说明有多糖、酚类等杂质污染。SDS法和尿素法提取的DNA浓度较高，其D260 nm/D280 nm值均低于1.8，说明有蛋白质、有机物等杂质污染。

表2 银柴胡鲜根总DNA提取纯度及浓度

由表3可知，对于干根DNA的提取，试剂盒法和高盐低pH值法提取的DNA的D260 nm/D280 nm值均在1.8～2.0范围，表明其DNA纯度较高；2% CTAB法、4% CTAB法和SDS法提取的DNA浓度相对较高，其D260nm/D280nm值均在2.0以上或小于1.8，说明有杂质污染。尿素法提取的DNA浓度最低，说明提取效果欠佳。

表3 银柴胡干根总DNA提取纯度及浓度

2.2 琼脂糖凝胶电泳检测

由图1可知，试剂盒法所提银柴胡叶片DNA完整性较好，电泳条带单一；2%和4%CTAB法提取的DNA浓度较低，且稍有降解；SDS法和尿素法提取的DNA条带清晰，浓度高，但有拖尾，降解较严重；高盐低pH值法提取DNA泳道无条带，电泳未检出DNA。6种提取方法中，试剂盒法提取的DNA电泳条带最整齐明亮，说明DNA完整，该结果与紫外检测结果一致。因此，后续试验可以选择用试剂盒法提取银柴胡叶片DNA，用于中药条形码序列ITS2的扩增。

由图2可知，试剂盒法提取DNA条带最亮，浓度最高，条带完整，提取效果最好。4% CTAB法提取的DNA条带单一，完整性好，但亮度不高，说明浓度低。其他3种方法提取的DNA都有降解，其中尿素法降解最严重，该结果与紫外检测结果一致。因此，后续试验可以选择用试剂盒法提取银柴胡鲜根DNA，用于中药条形码序列的扩增。

由图3可知，试剂盒法和高盐低pH值法提取干根的条带单一，降解较少，质量好，浓度高。未检测到尿素法提取的DNA，其他3种方法的DNA降解都较多。该结果与紫外检测结果一致。其中试剂盒法成本相对较高，故后续试验可以选择高盐低pH值法提取银柴胡干根的DNA，用于中药条形码序列的扩增。

2.3 PCR扩增检测

由图4可知，银柴胡叶片、鲜根和干根均可扩增出清晰的DNA条带，表明用对应方法提取银柴胡DNA的质量完全能够满足后续ITS2和psbA-trnH序列的PCR扩增反应要求。

3 讨论与结论

DNA条形码研究包括DNA提取、PCR扩增、DNA测序以及基于条形码数据库的序列比对等工作，获得高质量的基因组DNA，是进行DNA条形码研究的前提。目前，提取植物基因组DNA的方法有很多，如CTAB法、SDS法、高盐低pH值法、尿素法、试剂盒法等[10]。CTAB法能有效除去材料中的蛋白质、多糖和酚类等物质，但由于步骤多、试剂组成复杂、易污染等缺点，在使用上受到了一定的限制；SDS法操作简单、温和，但对于次生代谢物、多糖等含量较高的植物，提取出的基因组DNA质量往往不高；高盐低pH值法操作方便省时，所需样品量少，适用于濒危植物或干燥药材DNA的提取[11-12]；试剂盒法提取基因组DNA因其操作简单、快速，得到的总DNA纯度高，近年来已被广泛采用；尿素法操作温和、简单、快速，但其DNA质量不高[13]。本研究选择6种常用的DNA提取方法，筛选出提取银柴胡叶片、鲜根和干根的最适方法，其中试剂盒法提取3种材料的DNA质量和浓度都较好，因后续试验中样品处理量较大，且费用有限，考虑到提取成本，银柴胡叶片和鲜根采用试剂盒法提取DNA，而干根采用高盐低pH值法提取DNA。在用试剂盒提取时也应注意：在漂洗吸附柱时，加入漂洗液后可静置1 min后再进行离心，从而提高DNA的质量；加入TE缓冲液洗脱之前必须保证吸附材料彻底晾干，避免漂洗液中的乙醇等溶剂影响后续试验。用高盐低pH值法提取时，应将干根提前放于-70 ℃冷冻过夜，可以提高材料脆性，易于粉碎；加入提取液研磨后于65 ℃水浴，时间不宜过长，60 min即可，太长会加快DNA的降解。

银柴胡根中富含多糖、多酚、纤维和贮藏物质等，极易氧化，且蛋白质含量高，DNA提取溶液浑浊，产率较低，在研磨前加入PVP和β-巯基乙醇可防止多元酚类物质氧化[14]。另外，样品处理时组织研磨机的转速和时间会影响细胞破碎的效果，故对其进行了优化，既能使药材研磨完全，又能降低DNA的损失，选出的干根最佳研磨条件为1 600次/min，研磨6 min，提高了DNA的质量和产率。

从银柴胡鲜根中提取的DNA浓度较干根高，但纯度相对较低，原因可能是新鲜材料活性较高，DNA降解少，各种代谢产物和后含物含量高，在提取过程中不易去除干净；干根由于晾干过程时间长、温度高，造成DNA大量降解，因此得率低，完整性差。而叶片提取的DNA浓度低，可能与叶片比根取样量相对少有关。另外，以优选方法提取的银柴胡叶片、鲜根和

干根总DNA能够扩增出ITS2和psbA-trnHDNA条形码序列。本研究根据不同方法对银柴胡叶片、鲜根和干根DNA提取的检测结果，比较得出相对适合的银柴胡不同材料总DNA提取方法，为后续的DNA条形码分子鉴定及分子生物学研究奠定了基础。