分散固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定禽蛋中4 种内外源性孕激素

黄丽英，邹 圆，陆 强，范栋杰，顾 捷，龙 举，张月星,*

孕激素是一类由卵巢黄体细胞分泌维持妊娠所必需的的二十一碳类固醇激素，主要以孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮等为主，长时间食用含有孕激素的食品可能产生恶心、头痛、月经紊乱、卵巢肿大等问题[1]。禽蛋又名禽卵，是家禽所产的卵，富含卵磷脂、固醇类、多不饱和脂肪酸等营养物质，是一种营养价值较高的方便膳食补充来源[2-3]。禽蛋类食物本身含有内源性孕酮，其食用健康安全性尤其对儿童发育的影响备受关注，但鲜见有相关研究资料表明禽蛋天然内源性孕酮与食品安全有关，同时饲养过程中使用外源性激素（如醋酸美伦孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮）对禽蛋中内源性激素含量变化的影响也不明晰，而且禽蛋中相关的国家食品标准亦没有对孕激素进行限量的规定[4]。因此有必要建立准确、高效的禽蛋中孕激素的检测方法，利于掌握和分析禽蛋中内外源性孕激素含量，为开展禽蛋中孕激素的安全性评价提供可靠的分析测定依据，对保障农产品安全具有现实意义。

目前激素的检测多集中在β激动剂[5]、糖皮质激素[6]方面，而且主要在环境水体[7-8]、化妆品[9]、生物样品[10-11]方面，其中最常用的方法为液相色谱法[12]、气相色谱-质谱法[13]、液相色谱-串联质谱法[14]等，其中液相色谱法抗干扰能力较弱，气相色谱-质谱法需要衍生化，大多应用于环境中的雌激素检测，液相色谱-串联质谱法具有定性能力强、选择性好、灵敏度高等优点，已广泛地应用于食品领域。Yang Yi[15]、Wang Quanlin[16]等建立了禽蛋中性激素的液相色谱-串联质谱法，但禽蛋中4 种孕激素同时测定的方法鲜见报道。国家也陆续发布了相关标准[17]，GB/T 21981—2008《动物源食品中激素多残留检测方法液相色谱-质谱/质谱法》对动物源性食品中的激素进行多残留检测，因该标准是在特定背景下推出，标准推出时间仓促，涉及范围太广，采用双柱联合的方式回收率不甚理想[18-19]。分散固相萃取技术是在提取液中直接加入吸附剂粉末进行净化，由Lehotay[20]和Anastassiades[21]提出的一种快速、简单、廉价、高效、可靠和安全的前处理技术QuEChERS（quick, easy, cheap, effective, rugged, safe），最早在农药多残留中使用，近年来已越来越多的应用于药物残留检测[22-28]。先进的QuEChERS样品预处理技术目前也逐渐应用于禽蛋中各种硝基咪唑类、氯霉素等抗生素检测[29-30]。本实验采用分散固相萃取进行样品净化，运用超高效液相色谱-串联质谱（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）技术，建立了禽蛋中4 种孕激素同时检测的方法。实验使用正己烷提取，成功解决了蛋白质变性结块从而包裹目标物的问题，同时借鉴国际上通用的分散固相萃取技术在净化过程中利用N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）固相吸附剂有效除去了蛋黄素、卵磷脂等后期氮吹对目标物回收率产生影响的物质，极大提高了回收率，拓展了分散固相萃取技术在禽蛋中激素检测领域的新应用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲醇、正已烷（均为色谱纯） 德国Merck公司；甲酸（色谱纯） 美国Tedia公司；C18和弗罗里硅土上海安谱科学仪器有限公司；PSA 美国Sigma公司。

雌性激素标准物质：孕酮、醋酸美伦孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮 德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；同位素：孕酮-D9内标 加拿大C/D/N ISOTOPES公司。

分别称取10 mg各标准品于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解，配制成1 mg/mL的储备液，并密封贮存于-20 ℃冰箱中。使用时用流动相或基质提取液将混合标准溶液稀释成一系列质量浓度的标准溶液，待测。

1.2 仪器与设备

ACQUITYTMUPLC仪、XEVO TQ-MS MS/MS仪 美国Waters公司；WH-861涡旋混合器 太仓华利达实验设备有限公司；ZHWY-110X往复式恒温培养振荡器上海智城分析仪器制作有限公司；HGC-36A氮吹仪天津市恒奥科技有限公司；BIOFUGE STRATOS高速冷冻离心机 美国Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 仪器条件

为获取较高灵敏度，采用注射泵连续进样方式对4 种标准物质和1 种内标物的质谱参数包括检测离子对、锥孔电压、碰撞能量等进行自动调谐优化。其他质谱条件：孕激素采用电喷雾离子源（electrospray ionization，ESI）正离子模式；毛细管电压：3.0 kV（＋）；离子源温度：150 ℃；脱溶剂气温度：500 ℃；脱溶剂气流量：1 000 L/h；碰撞池压力：3.0×10-3mbar。

1.3.2 色谱条件

采用ACQUITY UPLC BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）分离。柱温为35 ℃，样品温度为25 ℃，进样体积为5 μL，流速为0.2 mL/min。根据激素的化学性质，选择甲醇-水、乙腈-水和甲醇-0.1%甲酸溶液3 种不同流动相对色谱峰的峰形以及分离效果进行优化。最终选取流动相A相为0.1%甲酸溶液，B相为甲醇。梯度洗脱：0～1.5 min，30% B；1.5～4.0 min，30%～80% B；4.0～5.0 min，80% B；5.0～5.5 min，80%～30% B；5.5～8.0 min，30% B。

1.3.3 样品前处理

1.3.3.1 提取

将新鲜禽蛋打碎搅拌均匀后称取样品2.0 g于50 mL具塞塑料离心管中，加入10 mL正己烷，涡旋3 min，振摇10 min，在4 ℃、10 000 r/min离心10 min后，取上清液至玻璃管中。再用10 mL的正己烷重复提取一次，合并上层有机液，在45 ℃氮气吹干，待净化。在提取条件优化的过程中，主要对乙腈、乙酸乙酯、叔丁基甲醚、甲醇和正己烷5 种提取溶剂，振荡提取法、均质提取法以及超声提取法3 种提取方式的提取效率进行回收率实验比较。

1.3.3.2 净化

加入1 mL的甲醇-水（1∶1，V/V）复溶残渣，倒入装有50 mg PSA的2 mL高速离心管中，振摇10 min，放入冰箱－20 ℃冷冻静置10 min后，以14 000 r/min离心10 min，取澄清液经0.22 μm滤膜过滤后上机测定。在净化条件优化的过程中，考察弗罗里硅土、PSA和C18不同吸附剂种类和用量对净化目标化合物的影响。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

采用注射泵连续进样进行孕激素的分析，孕酮、醋酸美伦孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮和孕酮-D9共5 种标准品采用ESI＋离子化模式，对标准溶液分别进行全扫描，对毛细管电压、锥孔电压进行充分的优化，确定准分子离子峰。再使用子离子扫描方式，调节碰撞能量，分别选取经碰撞后所得丰度较高、碎片结构合理的两个子离子作为定量和定性离子，并优化其最佳碰撞能量。最终确定的质谱参数见表1。

2.2 色谱条件的优化

分别选择甲醇-水和乙腈-水作为流动相同时分析4 种孕激素的分离效果，发现乙腈-水并不能使这4 种离子完成出峰，而甲醇-水可以使醋酸甲地孕酮、醋酸美伦孕酮、醋酸氯地孕酮、孕酮4 种孕激素分离出峰，但4 种孕激素则峰形很差。为了提高孕激素化合物的离子化效率，在水相中加入0.1%甲酸，各激素的峰形和灵敏度有了较大改善。因此分别采用甲醇-0.1%甲酸溶液为流动相分析4 种孕激素，图1为ESI＋离子化模式下4 种孕激素标准溶液的MRM色谱图。

图1 ESI+离子化模式下4 种孕激素标准溶液的MRM色谱图Fig. 1 MRM chromatograms of standard solutions of progesterone hormones under ESI+ mode

2.3 前处理技术的优化

2.3.1 提取方式的选择

实验对振荡提取法、均质提取法以及超声提取法在提取禽蛋中孕激素的效果进行了比较。选取3 组样品，每组加入相同的标准混合溶液后加入等量的提取溶剂，第1组采取振荡提取法，时间10 min；第2组采用均质提取法，时间10 min；第3组采用超声波提取法，时间10 min。其他处理步骤如1.3节，结果如表2所示。

表2 3 种不同提取方式的回收率比较Table 2 Comparison of recoveries of three different extraction methods

从表2可以看出，振荡提取效果最好，其次是均质提取，最差的为超声提取。这可能是禽蛋样品蛋白质含量比较高，样品比较黏稠，声波空化作用导致部分蛋白质分散，加大了对目标化合物的包裹，所以选取振荡提取方式作为本实验样品的提取方式。

2.3.2 提取液的选择

孕激素类化合物的极性一般表现为较弱或者中等，提取溶剂常用的有乙腈、乙酸乙酯、叔丁基甲醚、甲醇、正己烷等。实验分别选取了乙腈、乙酸乙酯、叔丁基甲醚、甲醇、正己烷作为提取溶剂进行比较，效果见图2。考虑到禽蛋中含有大量的卵磷脂和脑磷脂，直接用乙酸乙酯和叔丁基甲醚提取，提取液中会形成较多的白色稠状物，影响净化结果。结合振荡提取方式，考察乙腈、甲醇等不同提取溶剂的提取效率，发现使用乙腈与甲醇提取立刻使蛋白质变性，形成大的颗粒状物质，对目标物进行包裹，极大地降低了回收率，并且禽蛋中的蛋黄素会被乙腈和甲醇提取出，氮吹时这些蛋黄素等物质也会把目标物包裹。使用正己烷提取，禽蛋中的蛋白质在正己烷中并不结块，且呈现分散状，故很好地解决因蛋白质变性对目标物包裹问题，其次实验用正己烷提取，可以省去无水硫酸镁除水步骤，既节省了时间又减少了吸附性损失。

图2 不同提取溶剂对4 种孕激素提取效率的影响Fig. 2 Effects of different solvents on the extraction efficiency of 4 progesterone hormones

2.3.3 分散固相萃取条件的选择与优化

2.3.3.1 吸附剂种类的选择

本实验采用分散固相萃取进行净化，分别对弗罗里硅土、PSA和C18进行了比较。结果表明，弗罗里硅土是一种强极性吸附剂，对基质液中的脂类、糖类没有净化作用；PSA和C18能除去基质中的脂肪酸和糖类物质，但同时C18对孕激素吸附比较大，导致提取率下降，而PSA对孕激素吸附作用小，故选择PSA作为吸附剂，见图3。

图3 分散剂对4 种孕激素的吸附能力Fig. 3 Adsorption capacity of dispersant toward 4 progesterone hormones

2.3.3.2 吸附剂用量的优化

实验考察30、40、50、60、70、80、90 mg等不同质量的PSA对4 种孕激素的净化效果，如图4所示。当PSA为30 mg时，4 种孕激素的回收率为107.3%～140.1%，这一方面可能是禽蛋中自带的孕激素对回收率的影响，另一方面可能是禽蛋样品中未被除去基质干扰物对目标分子具有基质增强作用。当PSA含量为50～60 mg时，除孕酮外的3种孕激素的回收率为92.8%～99.0%。当PSA的用量进一步增加时，致使回收率降低，可能是PSA中的—NH2与孕激素的羰基发生氢键作用的几率增加。综上所述，选择吸附剂用量为50 mg。

图4 不同质量的PSA对4 种孕激素的净化效果Fig. 4 Purification efficiency of different amounts of PSA for 4 progesterone hormones

2.3.3.3 富集后处理的优化

实验改变了一般QuEChERS方法的净化步骤，改成氮吹定容后再净化，一方面提高了PSA的利用率，避免了小质量净化颗粒对大体积试剂净化效果不佳的影响，另一方面避开了一般QuEChERS方法部分提取不均对浓度折算的误差。此外，冷冻10 min后离心，能有效去除去小部分的油脂，达到低温脱脂的效果。

2.4 方法学验证

2.4.1 线性关系、检出限和定量限

用除含孕酮外的3 种孕激素含量均低于检出限的禽蛋作为基质样品，经前处理得到样品基质液，用基质提取液配制醋酸美伦孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮的混合标准溶液，以目标化合物的峰面积（y）对其相应的质量浓度（x）分别绘制外标标准曲线。孕酮用流动相配制0.4～100 μg/L范围的一系列标准溶液，各点内标质量浓度均为10 μg/L，绘制内标法校准曲线。4 种孕激素具有良好的线性关系，相关系数r2均大于0.996。根据3 倍信噪比确定检出限，10 倍信噪比确定定量限，具体见表3。

表3 4 种孕激素的线性方程、相关系数、检出限和定量限Table 3 Linear equations, correlation coefficients, limits of detection,and limits of quantitation for 4 hormones

2.4.2 回收率和精密度实验结果

分别在已知孕酮含量的禽蛋样品中添加3 种不同水平的4 种孕激素混合标准溶液，按1.3节方法进行预处理，每个水平重复测定6 次，分别计算平均回收率和相对标准偏差，具体见表4。可以看出3 种加标水平下，醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸美伦孕酮和孕酮4 种孕激素的回收率分别为85.7%～99.7%、86.4%～96.8%、85.3%～94.5%、79.5%～88.6%；相对标准偏差分别为4.2%～9.5%、1.4%～4.5%、3.8%～5.7%、2.3%～4.7%，可以满足日常样品分析要求。

表4 禽蛋中4 种孕激素的加标回收率与相对标准偏差（n=6）Table 4 Recoveries and RSDs of 4 progesterone hormones in spiked egg (n = 6)

2.5 实际样品分析和确证

对从超市、菜场购买的36 批次禽蛋进行测定，禽蛋试样中MRM离子流色谱图如图5所示，孕酮处有明显的色谱峰，应为内源性孕酮，孕酮的含量在5～65 μg/kg之间。为了验证本方法的准确性，用离子阱飞行时间质谱通过多级质谱图进行分析，对孕酮阳性样品进行了确证。图6为禽蛋中检出的孕酮三级质谱图，与标准品的多级质谱图母离子（m/z 315.232 7）、二级子离子（m/z 297.220 0）以及三级子离子（m/z 203.434 0）的质量数偏差分别为－3.9、－0.1、0.5 mDa，可以准确地对该样品进行定性分析。

图5 鸡蛋样品孕酮和孕酮内标提取离子流图Fig. 5 Extracted ion chromatograms of egg samples and internal standard

图6 鸡蛋样品中孕酮的三级质谱图Fig. 6 Mass spectra of positive egg samples

3 结 论

本实验采用分散固相萃取-UPLC-MS/MS技术建立了同时检测禽蛋中4 种孕激素的分析方法，通过仪器条件、提取溶剂和方式、吸附剂种类和用量方面的优化考察，方法的检出限为0.2 µg/kg，回收率在79.5%～99.7%之间，方法学评价表明该方法灵敏度高、回收率好。尤其使用正己烷作为提取溶剂并结合振荡提取法，可避免禽蛋中蛋白质变性对目标分析物进行包裹的现象从而提升测定的回收率。同时在净化过程中使用PSA吸附剂有效除去了禽蛋中蛋黄素、卵磷脂等后期氮吹对目标物回收率产生影响的物质，重复性好，相对标准偏差均小于10%。相比GB/T 21981—2008双柱联合净化，该方法简化了实验过程，提高了净化效率和净化速度，缩短了分析时间。本方法还通过离子阱飞行时间质谱多级质谱分析功能，对孕酮阳性样品进行了确证。优化后正己烷提取、PSA净化的UPLC-MS/MS测试方法操作简便、灵敏度高、实用性强，其回收率及重复性能满足日常检测的要求。