uc.12+A及其宿主基因SFPQ在小鼠B淋巴瘤细胞中的表达研究

长链非编码RNA(lncRNA)是长达200个核苷酸以上的RNA转录本,它们不编码任何蛋白质[1]。超保守区域(ultraconserved regions, UCRs)是存在于基因组中一些DNA序列,在不同物种之间高度保守[2],目前已发现有481个>200 bp的基因片段均属于超保守区域。在这些超保守区域中部分可以转录,它们的转录产物叫做T-UCRs(transcribed ultraconserved regions,T-UCRs)[3],属于lncRNA。超保守区域通常位于癌基因相关的脆弱位点,有文章报道T-UCRs的表达水平在人类的膀胱癌[4]、肝癌[5]、结肠癌[6]、神经母细胞瘤[7]等多类肿瘤中均发生显著改变,这些表达水平发生变化的T-UCRs是否具有生物学功能是人们迫切要知道的。近几年来越来越多的证据表明，T-UCRs在肿瘤的发生、发展过程中起着至关重要的作用[8]。

脯氨酸/谷氨酰胺富含性剪接因子(splicing factor proline and glutamine rich,SFPQ)是在脊椎动物体内广泛表达的核蛋白[9],它在调控哺乳动物的昼夜节律方面发挥重要作用[10]。同时也是体内重要的抑癌蛋白, SFPQ可通过下调泛素样蛋白LC3B来增强结肠癌细胞的凋亡[11]。也有文献报道,它与lncRNA NEAT-1结合调控体内免疫应答[12];与肺癌转移相关转录本1(MALAT1)结合,上调多嘧啶串结合蛋白2(PTBP2)的表达水平,从而促进直肠癌肿瘤生长与转移[13]。在小鼠体内,SFPQ通过与非编码RNA Vl30特异性结合来调控下游基因的表达水平[14]。人SFPQ基因位于1号染色体上,全长9533 bp,鼠的SFPQ基因位于4号染色体,全长9935 bp。两者均由10个外显子和9个内含子构成,在该基因的第9号外显子和第10号外显子之间的内含子中,有一段超保守序列,编码产物为uc.12+A。关于uc.12+A是否具有生物学功能及其与SFPQ之间是否具有调控作用目前尚无相关文献报道。

由于uc12+A是转录自SFPQ基因的反义链,因此本文拟采用链特异性逆转录聚合酶链式反应(strand-specific RT-PCR)的实验方法检测uc.12+A在B淋巴瘤细胞中的表达,同时用实时荧光定量PCR及Western Blot技术检测SFPQ在B淋巴瘤细胞中的表达情况,以了解两者在B细胞淋巴瘤中表达的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞培养:小鼠B细胞淋巴瘤细胞株(38B9和myc3)由本实验室提供。分别用DMEMF-12培养基,α-MEM培养基加10%胎牛血清、1%青-链霉素,在37 ℃,5%CO2条件下培养。利用CD19磁珠抗体从小鼠脾脏中分选正常B细胞。

1.1.2 试剂与仪器设备: TRIzol(Invitrogen公司);三氯甲烷、异丙醇(中国恒利试剂化学试剂公司); DEPC(上海生物工程有限公司);无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司);逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒(TakaRa公司)。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。SFPQ抗体(Millipore,美国); GAPDH 抗体(Vazyme,中国);SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(碧云天,中国);冷冻离心机(Thermo,美国);细胞培养箱(Thermo,美国);核酸蛋白定量仪(Eppendorf,美国);凝胶成像系统(上海天能科技有限公司);实时荧光定量PCR仪(ABI,美国)。

1.2 方法

1.2.1 引物设计:在ucbase、pubmed数据库中分别查出uc.12+A、小鼠SFPQ的基因序列,设计链特异性逆转录引物和定量PCR引物。见表1，2。

表1 链特异性逆转录引物

表2 实时荧光定量PCR引物

1.2.2 strand-specific RT-PCR检测uc.12+A、SFPQ表达。

1.2.2.1 sfrand-specific RT-PCR:使用Takara逆转录试剂盒进行逆转录反应,严格按照说明书进行实验,取1μg 38B9和myc3的总RNA分别加入0.2 mL离心管中,进行去除基因组DNA纯化。随后使用链特异性引物进行逆转录反应。37 ℃逆转录15 min,85 ℃灭活5 s,待降温至4 ℃时取出,用RNase free H2O五倍稀释,-20 ℃冰箱保存。

1.2.2.2 实时荧光定量PCR:取稀释后的cDNA 2μL,SYBRⅡ10μl,上游引物和下游引物各0.5μL,Rox 0.4μL,RNase free H2O 6μL加入8连管,每个样本加3个复孔,混匀, 用ABI7500实时荧光定量PCR仪检测样本。反应条件:第一步:95 ℃;第二步:95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,40个循环;第三步:95 ℃ 15 s,55 ℃ 30 s,95 ℃ 30s。

1.2.3 Western Blot 检测SFPQ表达:收取细胞,加入蛋白裂解液(含磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂)提取蛋白,用BCA法进行蛋白定量,按每孔40μg蛋白上样进行SDS-PAGE凝胶电泳,浓缩胶浓度为5%,分离胶浓度为10%。采用湿转的方法将蛋白转至PVDF膜上,5%BSA室温封闭2 h,加SFPQ抗体(稀释浓度1∶1000),4 ℃孵育过夜, 二抗室温孵育1 h(稀释浓度为1∶10000),使用化学发光成像分析仪显影成像。

1.3 统计学分析 所得数据使用SPSS 16.0统计软件进行统计学分析。计量数据以均数±标准差表示。数据分析采用独立样本t检验及Spearson相关性分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 uc.12+A在小鼠B淋巴瘤细胞中的表达 使用链特异性引物时,uc.12+A的表达比用普通的随机引物低,两种检测方法中uc.12+A在B淋巴瘤细胞中的表达均高于正常B细胞,差异有统计学意义(P<0.01),见图1。

2.2 SFPQ在小鼠B淋巴瘤细胞中的表达

2.2.1 SFPQ基因表达水平:SFPQ在小鼠B淋巴瘤细胞中的表达明显升高,差异具有统计学意义(P<0.01)。见图2。

2.2.2 SFPQ蛋白表达水平:SFPQ在B淋巴瘤细胞株中蛋白水平明显高于正常B细胞,差异具有统计学意义(P<0.05)。见图3。

2.3 uc.12+A与SFPQ在B淋巴瘤细胞中表达的相关性 分析统计结果显示两者呈显著正相关(R2=0.8354)。

注:**P<0.01;A:普通RT-PCR;B:strand-specific RT-PCR图1 实时定量PCR检测uc.12+A在B淋巴瘤细胞中的表达

注:**P<0.01图2 普通RT-PCR检测SFPQ在B淋巴瘤细胞中的表达

注:*P<0.05;A:western blot 电泳图; B:灰度值分析统计图图3 Western blot 检测SFPQ蛋白在B淋巴瘤细胞中的表达

3 讨论

lncRNA不编码蛋白质,但会表现出类似mRNA的结构特征,例如外显子基因结构和poly(A)尾巴，具有组织学和发育学特异性的表达模式。

到目前为止已经发现很多种在癌组织中表达出现异常的T-UCRs,其对肿瘤的发生发展起着至关重要的作用。然而超保守RNA有的在正义链上表达,有的在反义链上表达,使用传统的RT-PCR方法时,反转录体系中的所有RNA都充当了cDNA的第一链模板,无法准确检测出正义链或反义链上的T-UCR的表达情况。针对这个问题,我们用与T-UCR互补序列的寡核苷酸作为特异性逆转录引物,取代随机六聚体引物进行RT-PCR,只产生所需要的cDNA,从而产生更为特异性的PCR扩增。实验结果显示，来自反义链的uc.12+A在B淋巴瘤细胞株中,sfrand-pecific RT-PCR组表达比普通RT-PCR组低,但在这2种实验方法中uc.12+A在38B9和myc3中表达增高的总趋势没有改变。本研究提示,与普通的RT-PCR相比,sfrand-pecific RT-PCR能更精确地检测T-UCRs的表达情况,为检测T-UCRs表达提供新方法。

SFPQ作为一种抑癌蛋白,已涉及无数核功能,包括DNA修复、转录调控、剪接和RNA转运[15],可与dsDNA在许多基因的启动子上相互作用,从而发挥着控制转录调控的功能。它也是DNA双链断裂修复通路的重要参与者,直接与DNA以及DNA修复蛋白结合[16-17],并且迅速定位于细胞内的DNA损伤部位[23],有数篇文献报道SFPQ与lncRNA结合,在肿瘤的发生发展中发挥重要功能。而uc.12+A位于SFPQ蛋白编码基因的内含子上,本研究首先通过sfrand-pecific RT-PCR的方法检测发现uc.12+A在B淋巴瘤细胞中表达升高,随后进一步检测其宿主基因SFPQ在同种淋巴瘤细胞株中的表达情况,发现SFPQ的表达趋势无论在mRNA水平还是蛋白水平上都与uc.12+A一致。初步研究结果表明,uc.12+A与其宿主基因SFPQ在B细胞淋巴瘤中的表达水平均呈现增高的特点,且具有一定相关性,两者之间的是否具有相互调控作用以及其对B细胞淋巴瘤的发生发展的影响有待进一步研究。