改良性柑橘果胶通过下调Galectin-3抑制膀胱癌细胞生长*

方 天 吴 迪 梁 磊 胡文娟 董 敏 许龙翔 恽时锋

(1.南京军区南京总医院比较医学科，南京 210002)(2.南京军区南京总医院信息科，南京 210002)

数据显示膀胱癌是男性中第六大癌症[1]，虽然通过膀胱手术切除可以清除体内癌细胞，但仍有一半膀胱切除术后病人仍在两年内复发[2]。此外，需要经常进行跟踪和监测，以及手术后反复进行临床干预和终身管理，使膀胱癌治疗比其他任何癌症花费更大[3]。通过酸碱水解柑橘果胶(Citruspectin,CP)可制得改性柑橘果胶(Modifiedcitruspectin,MCP)，果胶能防治肿瘤虽早为人知,但通常指能抑制结肠癌发生的不溶性膳食果胶。由于MCP比CP水溶性好,因而更易在体内发挥作用[4]。MCP是一种具有抗癌活性的多糖[5],其靶点可能是半乳糖凝集素-3(Galectin-3,Gal-3)[6]。Galectin-3作为β-半乳糖苷结合蛋白家族的一员，是一种多功能蛋白；参与肿瘤细胞的生长，细胞分化，细胞黏附，细胞凋亡，恶性转化或者转移等过程[7]。值得一提的是，Galectin-3通过杀伤T细胞和干扰NK细胞功能来监管肿瘤微环境[8]。Ahmed等正在提出治疗癌症另一可能的治疗策略：即使用一些碳水化合物配体如MCP阻滞Galectin-3活性，从而达到对癌症治疗[9]。

Galectin-3在膀胱癌组织样品中表达升高已有报道[10]。本课题旨在探讨对膀胱癌移植瘤小鼠灌胃改良性柑橘果胶(MCP)，能够抑制肿瘤的生长和增殖，MCP或许是治疗膀胱癌的有效方法。本研究中体内研究检测了MCP对人膀胱癌细胞T24和J82细胞存活和细胞凋亡的影响；体外研究则检测出MCP能显著抑制T24移植瘤的生长。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

人膀胱癌细胞系T24和J82来自中科院细胞库(上海，中国)。细胞培养条件：培养在完全培养基中(1640培养液+10%胎牛血清，pH 7.2)，置于37 ℃、5% CO2恒温培养箱内，每天更换培养液，细胞培养至80%～90%融合率，0.25%胰蛋白酶消化传代。

1.2 细胞增殖检测

取处于对数生长期(汇度90%左右)的T24细胞和J82细胞，胰酶消化收集，96孔板接种细胞100 μL/孔，细胞数约3 000～5 000个/孔，培养24 h后弃去培养液，加入不同浓度的MCP，根据预实验结果，选取0.125、0.25、0.5、1.0和2.0% (mg/L)五个浓度组，空白对照组以培养液补足，每孔反应体系100 μL，每组5个复孔。取孵育72 h为检测时间点。细胞增殖检测操作步骤参照试剂盒说明书。按细胞增殖检测试剂盒准备好细胞后，在自动酶标仪(型号：ELX800；Bio Tek公司)上测560 nm光密度A值(OD)，设对照组和完全空白组(只添加100 μL培养液)。用下列公式计算细胞增殖存活率：细胞存活率=实验组A值/对照组A值×100%。

1.3 细胞凋亡蛋白检测

分别收集浓度为0、0.5、1.0和2.0%的MCP处理48 h的T24和J82细胞，加裂解液，提取细胞总蛋白。BCA法进行蛋白质定量。蛋白质免疫印迹法检测前列腺蛋白质的表达。具体方法：取 50 μg总蛋白样品于10%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转印至PVDF膜，用5%脱脂牛奶封闭后，一抗4 ℃孵育过夜。二抗室温孵育40 min，显色。β-actin作为一抗对照。光密度扫描半定量分析显影条带，目的条带和β-actin信号面积之比评定其蛋白水平。

用于蛋白印迹中的一抗来源：cv Caspase-3和cv PARP购自Cell Signaling Technologies公司, 和 Galectin-3 购自Abcam公司，β-Actin购自Santa Cruz生物公司。

1.4 动物实验

膀胱癌细胞株 T24 培养在完全培养基中(1640培养液+10%胎牛血清，pH 7.2)，置于37 ℃、5% CO2恒温培养箱内，每天更换培养液，细胞培养至80%～90%融合率，0.25%胰蛋白酶消化传代。接种于生长状况良好的5～6周龄Balb/c裸小鼠背部皮下，每只裸鼠接种细胞106～107,共接种12只裸鼠。肿瘤长至长径为0.5 cm左右大小时，分成3组，每组4只。改良柑橘果胶 (MCP，购自Eco Nugenics公司, 美国)溶于灭菌过的PBS。对照组每日灌胃PBS；MCP低剂量组按350 mg/kg·d-1进行灌胃；MCP高剂量组按700 mg/kg·d-1进行灌胃。三组裸鼠均灌胃6周。实验整个过程皆在SPF级动物房内完成。待移植肿瘤直径1～2 cm时，脱颈处死荷瘤裸小鼠，取移植肿瘤块放置4%甲醛溶液浸泡待用。

游标卡尺测量肿瘤长径a与短径b，按公式V=ab2/2来计算肿瘤体积。称量肿瘤湿质量和荷瘤裸鼠体质量并进行统计分析。

1.5 免疫组化

常规免疫组化检测肿瘤组织中Ki67 (1∶10 000, Vector Laboratories公司), cleaved Caspase-3 (1∶500, Cell Signaling Technologies公司), 和Galectin-3 (1∶100, Abcam公司)蛋白的表达，操作步骤：抗原修复，血清封闭；滴加一抗，切片平放于湿盒内4 ℃孵育过夜。滴加HRP(1∶200)山羊抗兔的IgG覆盖于组织上。DAB显色；复染细胞核；脱水封片，中性树胶封片。显微镜镜检，图像采集并进行数据统计分析。

1.6 统计方法

2 结果

2.1 体外研究MCP对膀胱癌细胞增殖和凋亡的影响

浓度为0.125、0.25、0.5、1.0和2.0%的MCP处理人膀胱癌细胞株T24和J82，细胞增殖有显著差异：对T24细胞活性有显著抑制作用的最低浓度为0.125%；而对J82细胞活性有显著抑制作用的最低浓度为0.5% (见图1A和B,P<0.05)。

浓度为0、0.5、1.0和2.0% (质量/体积) 的MCP分别处理人膀胱癌细胞株T24和J82 48 h后，细胞凋亡标志物Caspase-3和PARP的裂解产物表达变化：cv Caspase-3和cv PARP明显增多(见图1C)。

图1 MCP对膀胱癌细胞T24和J82细胞增殖和凋亡的影响注：A，B.不同浓度MCP对T24和J82细胞存活率的影响； C. Western blotting检测不同浓度MCP处理T24和J82细胞后，cleaved Caspase-3、cv Caspase-3和 Galectin-3蛋白表达量。** P<0.01; *** P<0.001Fig.1 Effects of MCP on cell proliferation apoptosis of T24 and J82 cellNote:A,B. Effects of MCP on cell viability by the SRB assay.C. Effects of MCP on cleaved Caspase-3、cv Caspase-3 and Galectin-3 proteins by Western blotting assay.** P<0.01; *** P<0.001

图2 MC抑制T24癌细胞移植瘤大小注：A.各组肿瘤图片；B.各组肿瘤湿重比较；C.各组肿瘤体积比较分析图，高剂量组(700 mg/kg)与对照组相比，体积显著减小(P<0.05)；D.实验过程中，各组裸鼠体质量没有差异。** P<0.01Fig.2 MCP inhibited the growth of T24 xenograftsin vivoNote: MCP inhibited the growth of UBC xenograftsin vivo. Photograph (A) and the average weights (B) of T24 xenografts harvested at the endpoint. Tumor volume (C) and body weight (D) of T24 xenograft-bearing mice with MCP treatment for 6 weeks.Three experimental groups, including 700 mg/kg MCP, 350 mg/kg MCP and Vehicle control, were measured. ** P<0.01

2.2 MCP对T24移植瘤的抑制作用

不同剂量MCP溶液，即0、350和700 mg/kg对荷瘤裸鼠连续灌胃6周后，脱颈处死荷瘤裸鼠，取肿瘤，游标卡尺测量肿瘤长径和短径，称量裸鼠体质量和肿瘤组织湿重，并进行统计分析。结果如下：高剂量组(700 mg/kg)的肿瘤大小和质量明显小于对照组(P<0.05)。几组裸鼠体质量没有差异，说明口服MCP对裸鼠没有明显副作用。

2.3 MCP对T24肿瘤组织增殖凋亡的影响

免疫组化实验探讨不同剂量MCP对T24移植瘤的肿瘤组织增殖凋亡以及潜在靶点Galectin-3的影响:肿瘤组织中，增殖标志物ki67和Galectin-3表达随MCP浓度增高而降低，而凋亡标志物cv Caspase-3则随浓度升高而升高(见图3A)。进一步量化分析蛋白表达量：高剂量组增殖标志物ki67表达显著降低(P<0.05，见图3B)；低剂量组和高剂量组凋亡标志物cv Caspase-3表达量均显著高于对照组(P<0.05，见图3C)。

图3 IHC检测各组肿瘤组织中ki67、cv Caspase-3和 Galectin-3的表达量比较注：A.IHC染色各组肿瘤组织ki67、cv Caspase-3和 Galectin-3图；B. 各组肿瘤组织Ki67阳性细胞数比较；C. 各组肿瘤组织cv Caspase-3阳性细胞数比较.*P<0.05;**P<0.01Fig.3 Expression of Ki67, cleaved Caspase-3 (cv Caspase-3) and Galectin-3 by IHCNote: A. Representative images of IHC staining for Ki67, cleaved Caspase-3 (cv Caspase-3) and Galectin-3 on tissue sections from MCP and vehicle-treated T24 xenografts. B.Proliferation index and apoptosis index were quantified by the positive IHC staining forKi67 and cleaved Caspase-3, respectively. Bars represented the mean ± SD.*P<0.05; **P<0.01

3 讨论

本课题首次在体内和体外研究中证明改良性柑橘果胶(MCP)，通过抑制膀胱癌细胞的增殖和诱导细胞凋亡来抑制肿瘤生长。MCP能降低潜在靶点Galectin-3的表达，而Galectin-3在膀胱癌样品中表达过量且预示着较差的预后。作为一种可食用纤维，据报道来自不同植物的果胶均有抑制癌细胞作用[11]。例如，苹果果胶能够诱导人胸腺癌细胞MDA-MB-231体外凋亡，和诱导鼠胸腺癌细胞4T1体内凋亡[12-13]。除了本课题证实的MCP能抑制膀胱癌细胞的增殖，诱导凋亡；MCP还能抑制前列腺癌和直肠癌细胞的侵袭和转移[14-15]。MCP除了对肿瘤细胞有抑制作用，还能够激活NK细胞对癌细胞的杀伤作用和对新生毛细血管的抑制作用[16]。总之，MCP对两种肿瘤细胞都有抑制作用，包括肿瘤微环境中的细胞。

MCP是一种水溶性柑橘衍生的多糖纤维，富含β-半乳糖残基；MCP的细胞毒性作用是通过结合蛋白Galectin-3或下调Galectin-3[17-18]。Galectin-3是经常在多种肿瘤细胞类型表达，并已知与细胞增殖、细胞生存、细胞黏附和转移相关[19]。总之，我们的数据表明，MCP抑制人膀胱癌细胞体内外增殖与存活。作为一种天然的膳食纤维，MCP是在人膀胱癌的化学预防和化疗药物的一个有吸引力的潜在药物。MCP抑制人膀胱癌生长的具体机制和其他治疗剂的联合治疗可在以后的研究中进一步探讨。