高效液相色谱法测定鸡肉中土霉素、四环素、金霉素和强力霉素残留量的方法优化探讨

◎ 夏洁贞，区敏霞

（佛山市高明区农业技术服务推广中心，广东 佛山 528500）

四环素类抗生素（Tetracyclines）是由放线菌产生的一类广谱抗生素，包括金霉素（Chlortetracycline)、土霉素（Oxytetracycline）、四环素（Tetracycline）及半合成衍生物甲烯土霉素、强力霉素和二甲胺基四环素等，其结构均含并四苯基本骨架。

近年来，抗生素在医疗和畜禽养殖业中的大量使用所导致的环境污染问题日趋严重，已成为国内外研究的热点之一。四环素类抗生素由于价格低廉，大量使用于许多疾病的预防与促进动物的生长，提高畜禽生产效率，兽用抗生素的使用大大促进了养殖业快速发展。同时由于四环素类抗生素相对稳定，具有一定的持久性，造成环境中四环素类抗生素的残留，从而间接或直接进入人体，增加人体的耐药性，给人类公共健康带来威胁[1]。为了保护环境和人身健康，许多国家都严格规定了四环素类抗生素在饲料中的添加限量及动物食品中的检出限量，我国也制定了国家标准规定四环素类抗生素的添加限量。目前，测定四环素类抗生素残留量的方法多种多样，参照国标要求本实验室根据实际情况利用高效液相色谱法测定畜禽肉中四环素类抗生素的残留量[2]，并对该方法进行了优化。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪（配备四元泵，自动进样系统）、柱温箱、DAD检测器、XDB-C18色谱柱、电子天平、离心机、高速分散器、漩涡振荡器、固相萃取装置、旋转蒸发仪、HLB固相萃取柱和WCX阳离子交换柱。

盐酸土霉素、盐酸四环素、盐酸金霉素和盐酸强力霉素标准品、磷酸二氢钠溶液、0.2 mol/L磷酸二氢纳溶液、0.1 mol/L柠檬酸溶液、Mcllvaine缓冲溶液、Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液、甲醇水溶液、标准储备液、混合标准工作液。

1.2 样品的制备

1.2.1 提取

称取6.00 g±0.01 g鸡肉样品于50 mL离心管内，加入30 mL 0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液，用高速分散器以10000 r/min均质1 min，于漩涡振荡器上震荡提取10 min，以10000 r/min离心10 min。把上清液倒入另一离心管中，残渣再加入20 mL缓冲液，重复提取一次，合并上清液。

1.2.2 净化

上清液以≤3 mL通过连接HLB柱的固相萃取装置，待上清液完全流出后，用甲醇水溶液5 mL洗柱，弃去全部流出液，真空抽干20 min，最后用15 mL乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液，再将洗脱液以≤3 mL通过连接WCX柱的固相萃取装置，待洗脱液全部流出后，用5 mL甲醇洗柱，弃去全部流出液，减压抽干5 min，再用4 mL流动相洗脱，洗脱液过0.45 μm滤膜，滤液供液相色谱测定。

1.3 样品的测定

1.3.1 色谱条件

色谱柱：XDB- C18柱（150 mm×4.6 mm id，5μm），色谱柱；流动相：乙腈+甲醇+0.01 mol/L草酸溶液（2+1+7）；流速：1.0 mL/min；柱温：25 ℃；检测波长：350 nm；进样量：50 μL。

1.3.2 标准曲线的制定

在1.3.1的色谱条件下对配制的标准系列溶液进样测定并绘制标准曲线，见图1～图4，标准品色谱见图5。

图1 土霉素标准曲线图

图2 四环素标准曲线图

图3 金霉素标准曲线图

图4 强力霉素标准曲线图

图5 100ng/mL的标准品色谱图

1.3.3 样品测定

在1.3.1的色谱条件下对净化后的滤液进样测定，外标法定量。空白样品色谱图参见图6，样品加标色谱图见图7。

图6 空白样品色谱图

图7 样品加标色谱图

2 结果与分析

2.1 标准曲线的线性分析

在1.3.1的色谱条件下，分别对混合标准系列溶液进行分析，得到符合分析要求的线性，线性回归方程、相关系数和线性范围参见表1。

表1 标准曲线的线性回归方程、相关系数和线性范围表

2.2 样品分析

本次样品选用养殖场的鸡肉15份，按照1.2方法制备样品溶液，在1.3.1的色谱条件下测定，外标法定量，结果表明，所有样品中4种四环素类抗生素的残留量均小于5 μg/kg。

3 讨论

3.1 色谱条件

本实验方法是对多种国标液相色谱方法[3]进行比较，最后参照GB/T 20764-2006《可食动物肌肉中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量测定 液相色谱-紫外检测法》[3]，选用的XDB-C18柱和流动相比例也可以对标准品和样品实现基线分离，达到较理想的分离效果，同时减少了梯度洗脱的繁琐，缩短分析时间。

3.2 线性和检出限

在1.3.1色谱条件下对标准系列溶液进行分析绘制的标准曲线线性能达到分析要求，实验结果显示4种四环素类抗生素的添加回收均达80%以上，本方法4种四环素类抗生素的检出限均能达到5 μg/kg。

3.3 方法的利弊

目前土霉素、四环素、金霉素和强力霉素的检测方法有生物检测法[4]和化学检测法。生物检测法虽然快速，但消耗的试剂盒量大价格昂贵且出现假阳性的几率较高，只适用于大批量样品的快速筛选，因此国际公认的确证方法仍是化学分析法。目前最常用的化学检测方法主要有高效液相色谱法[3,5]和高效液相质谱联用法[6]，其中农业部1025号公告-12-2008《鸡肉、猪肉中四环素类药物残留检测 液相色谱-串联质谱法》[6]适用于猪肉、鸡肉中四环素、土霉素及金霉素的残留检测灵敏度高，检测快速，该方法检测限为5 μg/kg，定量限为10 μg/kg，回收率在60%～120%，但是仪器价格昂贵使其广泛应用受到限制。而本法是普遍使用的高效液相色谱仪，根据4种物质的保留时间不同，然后通过DAD检测器在350 nm波长检测，同时实现了4种物质的检测，具有仪器成本相对较低，灵敏度高，定量准确，检出限达到5 μg/kg。不足之处是在提取和净化的过程中步骤复杂耗时长，但是本法相较于其他液相方法[2,7]净化效果比较好，样品基质杂质干扰小，今后仍需不断改进。