遮光处理对柴达木盆地黑果枸杞主要活性成分的影响

郝广婧，祁银燕，朱春云

（青海大学a.青海省农林科学院；b.青海高原林木遗传育种实验室；c.三江源生态与高原农牧业国家重点实验室，青海 西宁 810016）

青海省柴达木盆地是我国枸杞原生地之一。盆地具有独特的自然环境和高原气候，孕育出珍稀植物资源——黑果枸杞Lycium ruthenicum Murr.。盆地昼夜温差大，日照时间长，充足的光照环境诱导黑果枸杞在其浆果内积累了花青素、多糖、多酚、维生素和矿物质各种营养成分，尤其含有能清除自由基、具有抗氧化功能的花青素[1]。

黑果枸杞是重要的生态经济树种[2]。成熟的黑果枸杞果实中富含花青素，有关药理学的研究结果表明，这种黄酮类物质具有很强的抗氧化能力[3-5]，能够延缓衰老，同时能够预防心血管疾病[6-7]、肥胖和糖尿病[6]；其果实中含有的多酚具有提高免疫力，调控人的情绪、促进人体肠道健康等功效[8]；多糖具有一定的抗氧化活性[9]，有降血糖和抗疲劳功能[10]。曾琳娜[11]研究提出，香茹多糖具有抗肿瘤、抗氧化、抗病毒感染等功能。白鹏威[12]等人的研究结果也表明，果实的糖代谢和糖积累不仅与相关酶活性有关，也受遗传因子、植物激素、生态因子的调控和影响。外在环境通过影响黑果枸杞果实内相关代谢合成酶的活性来影响其营养物质的代谢和积累，而且在果实生长发育的不同时期其不同部位的酶活性不同。光是一个很重要的环境因子，调控植物的生长、发育和新陈代谢[13-14]，是植物合成有机物的能源[15]，光照强度的大小可以直接影响到植物生长和活性成分的积累[16]。为了探究光照对黑果枸杞果实中主要活性成分含量的影响情况，以柴达木盆地的黑枸杞果实为研究材料，在其果实生长发育的不同时期对其分别进行了光处理与暗处理，分析了光照对黑果枸杞果实中主要活性成分含量的影响情况。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试的植物材料为青海省柴达木盆地人工种植的黑果枸杞。

主要仪器设备：电子天平（BSA224S-CW）、电热鼓风干燥箱[DHG-9070(A) (101-1)]、紫外可见光光度计（N4S）、低温离心机（5810R，Eppendorf）、涡旋振荡器（XH-D，Thermo）。

1.2 实验设计

本研究按黑果枸杞果实发育过程和颜色变化，将果实从幼果期到成熟期的整个发育时期划分为5个时期（Stage）分别命名为S1、S2、S3、S4和S5（S-sample）：S1，果实为青绿色；S2，果实开始转色，明显附着紫色；S3，果实完全着紫色，开始膨大，硬度变小；S4，果实紫黑色，正在膨大；S5，果实黑色，完全膨大。本研究共设光处理与暗处理2个因素5个水平的两两对比处理。光处理：正常自然光照条件；暗处理：利用遮光袋模拟黑暗环境进行处理。分别对每个发育时期的果实进行套袋遮光处理，以正常光照条件下生长的黑果枸杞果实为对照，遮光处理10 d后分别测定果实内花青素、多糖及多酚的含量。

1.3 样品的处理与采集

1.3.1 样品的处理

为了研究光照对黑果枸杞果实表型形态和果实内主要活性成分的影响程度，我们分别采集了果实发育5个时期（S1—S5）遮光处理和自然光照条件（对照组）下生长的浆果进行研究，其中，L1～L5为5个时期自然光照条件下生长的浆果；D1～D5为5个时期遮光处理条件下生长的浆果，共采集了10组果实样品，各组果实样品的采集时间分别见表1。

表1 不同处理果实样品的采集时间Table 1 Collection time of different processed fruit samples

1.3.2 样品的采集

用剪刀分别剪下2个处理下5个时期的果实（带果柄），采集时戴好手套，避免用手直接接触果实，采摘后用锡纸包裹后置于液氮中冷冻，存于-80 ℃的冰柜中以备用。

1.4 测定项目与测定方法

1.4.1 花青素的测定

参考并改进汪洋、孙建霞等人有关花青素的提取方法[17-18]，准确称取0.1 g黑果枸杞干粉，加入1% HCL/CH3OH（v/v）的混合液5 mL，于4 ℃条件下黑暗浸提24 h。然后，将混合液以4 ℃/10 000 r离心30 min，冷冻离心后，将上清液转移到一个新的10 mL离心管中，向剩余沉淀物中再加入1% HCL/CH3OH（v/v）的混合液2 mL，重悬后于4 ℃条件下黑暗浸提24 h并离心。合并上清液，定容至10 mL，充分振荡后得到样品溶液。利用紫外可见光光度计在最大吸收波长530 nm处[19]测定。试验重复3次，测定值取3次技术重复的（平均值±标准差）。

1.4.2 多糖的测定

参考并改进刘晓涵等人[20]的苯酚硫酸法测定多糖。准确称取0.1 g黑果枸杞干粉加入80%乙醇溶液5 mL，于60 ℃下水浴30 min，充分振荡后将混合液以4 ℃/10 000 r离心30 min，冷冻离心后，将上清液转移到25 mL的离心管中，将滤渣用相同提取工艺提取至滤液无表色，重复浸提2～3次后合并滤液定容。吸取2 mL置于10 mL的离心管中，在沸水浴中蒸干，准确加入10 mL蒸馏水，充分搅拌使糖溶解。以4 ℃/3 500 r离心5 min，取1 mL上清液稀释50倍。精密加入5%苯酚溶液，摇匀后迅速加入硫酸5 mL，摇匀后常温下放置10 min，置于40 ℃水浴中保温20 min，取出后迅速冷却至室温，以相应的试剂为空白。以紫外-可见光分光光度法，在490 nm的波长处测定吸光度，试验重复3次，测定值取3次技术重复的（平均值±标准差）。

1.4.3 多酚的测定

参考GB/T8313-2008[21]中的茶多酚测定方法并加以改进，准确称取0.1 g黑果枸杞干粉加入50%的CH3OH溶液10 mL，震荡提取30 min。用超声波提取40 min，4 ℃/9 000 r离心15 min。滤渣用相同提取工艺提取至滤液无表色。合并滤液定容至50 mL的容量瓶中，取1 mL提取液稀释10倍，依次加入蒸馏水5.0 mL、10%的Filin-Ciocalteu试剂5 mL。充分震荡后静置3 min后，加入7.5%的Na2CO3溶液4.0 mL，摇匀，于35 ℃下恒温水浴1.5 h。显色后利用紫外可见光光度计在620 nm处测定并计算。试验重复3次，测定值取3次技术重复的（平均值±标准差）。

2 结果与分析

利用SPSS 18.0对黑果枸杞主要活性成分的实验数据进行差异显著性分析。

2.1 果实表型形态分析

果实的色素种类和含量决定了果实颜色的多样性。黑果枸杞在不同处理下各发育时期浆果的表型特征如图1～4所示。从图中可以看出，与对照组相比，在S1—S2时期遮光处理下的果实均有不同程度的褪色，且遮光处理下每个发育阶段果实生长都比较缓慢，但个体差异并不是十分明显的。

图1 自然光照下不同发育时期的浆果（正面）Fig. 1 Different developmental stages under the light(positive)

图2 遮光处理下不同发育时期的浆果（正面）Fig. 2 Different developmental stages under the dark (positive)

图3 自然光照下不同发育时期的浆果（立面）Fig. 3 Different developmental stages under the light (façade)

图4 遮光处理下不同发育时期的浆果（立面）Fig. 4 Different developmental stages under the dark (façade)

2.2 花青素含量分析

采用紫外分光光度计测定2个处理下黑果枸杞5个不同发育阶段果实中花青素的含量，结果如表2。

表2 不同光照条件下黑果枸杞果实各生长时期其花青素含量的测定结果†Table 2 Anthocyanidin contents of Lycium ruthenicum Murr. in different stages under different light conditions

由表2可知，光处理和暗处理下黑果枸杞果实内的花青素含量随着果实的逐渐成熟均呈逐渐增加后减少的变化趋势，从S1和S2这2个时期的测定结果可以看出，2个处理间存在差异，但差异不显著；从S3、S4和S5此3个时期的测定结果可以看出，2个处理下果实内的花青素含量均呈上升趋势，且都在S5时期有所回落。但是，暗处理下果实内花青素的含量会明显低于光处理的果实，且光处理下黑果枸杞在S3时期果实内的花青素含量就达到了5.02 mg·g-1，而此期暗处理下果实内的花青素含量仅有0.50 mg·g-1，存在极显著差异。

从表2中的花青素含量可以看出，2个处理下黑果枸杞果实内的花青素含量均在S4时期最高，且暗处理下果实内花青素的含量会略低于光处理，这一结果证明，光可能是影响花青素生物合成的关键环境因素之一，这为后续有关光诱导花青素生物合成深层分子机制的揭示奠定了物质基础。

2.3 多糖含量分析

采用苯酚硫酸法对光处理及暗处理下不同发育时期黑果枸杞果实内的多糖含量进行了测定，结果如表3。由表3可得，随着黑果枸杞果实的逐渐成熟果实内的多糖含量逐渐增加，在S1时期2个处理下果实内多糖含量间就存在显著性差异，而从S2到S5时期2个处理下黑果枸杞果实内的多糖含量均一直呈极显著差异，且在S3时期光处理下果实内的多糖含量呈急速上升趋势，而暗处理的果实在同一时期其多糖含量仅有2.39 mg·g-1，直到S4时期才出现急速上升趋势。因此，光照可能对黑果枸杞果实内枸杞多糖的积累有明显影响。

表3 不同光照条件下黑果枸杞果实各生长时期其多糖含量的测定结果Table 3 Polysaccharides contents of Lycium ruthenicum Murr. in different stages under different light conditions

2.4 多酚含量分析

采用Folin-Ciocalteau法对光处理及暗处理下不同发育时期黑果枸杞果实内的多酚含量进行了测定，结果如表4。由表4可得，光处理和暗处理下黑果枸杞果实内的多酚含量均随果实发育而逐渐增加。在S4时期其多酚含量均很高，随后在S5时期又有所缓减，且2个处理下果实发育时期的变化趋势相似，不存在显著性差异。光照对黑果枸杞果实内多酚的积累可能没有很显著的影响，对此研究结果（即光照对植物多酚有无影响的问题）我们还将进一步探讨。

表4 不同光照条件下黑果枸杞果实各生长时期其多酚含量的测定结果Table 4 Polyphenol contents of Lycium ruthenicum Murr.in different stages under different light conditions

3 结论与讨论

青海省柴达木盆地的黑果枸杞果实内含有丰富的花青素，这使得黑果枸杞的营养价值远高于红果枸杞。而花青素的合成与代谢是一个复杂的过程，不仅与相关的酶活性有关，同时受植物发育阶段和环境因素的调控[22]。目前，与植物发育和环境因素相关的花青素生物合成机制的影响因素仍不清楚。已有研究结果表明，光是影响花青素生物合成的关键环境因素之一[23]。在以前的许多研究中就提到花或果实中的花青素的积累是由强光诱导进行的，相比之下，在弱光或黑暗条件下，相关基因的表达被下调或抑制，这导致花青素在花和果实中的积累减少，从而产生白色或浅色的器官[24-27]。黑果枸杞中的枸杞多糖含量同样也很高，其主要成分为鼠李糖和阿拉伯半乳糖聚糖。近年来，由于多糖具有来源广以及抗氧化、降血脂、降血糖、抗菌多种活性功能的特点，所以有关枸杞多糖的研究已成为相关研究的热点之一[28]。黑果枸杞含有的多糖具有多种生物活性和很高的药用价值。白鹏威等人[6]研究提出，在一定条件下光照的减弱会减少植物果实内多糖的积累；殷培蕾等人研究发现，光照不仅影响植物中多酚的种类和生物量，还会改变其抗氧化活性[29]。由此可见，光照不足会引起光合作用减弱，致使果实变小，最终会导致果实产量与品质的减少和降低[30-32]。

本研究结果表明，遮光处理对黑果枸杞果实中花青素和枸杞多糖的积累均有显著影响。在自然光照条件下，黑果枸杞果实内的花青素含量范围在0.14～8.99 mg·g-1之间，在遮光条件下果实内的花青素含量只达到0.16～6.90 mg·g-1。另外，根据测定结果我们发现，在S3时期果实内的花青素和多糖均有一个非常显著的变化特点：此期自然光照条件下果实内的花青素含量高达5.02 mg·g-1，相比S2时期呈现出急速增长的趋势，而在遮光条件下同一时期果实内的花青素含量仅有0.50 mg·g-1；同样，在自然光照条件下生长的黑果枸杞其多糖含量已达到25.42 mg·g-1，相比S2时期的多糖含量呈现出激增趋势，而在遮光条件下果实内的多糖含量只有2.39 mg·g-1。这一测定结果说明，S3时期是花青素和多糖积累的一个非常关键的时期，在这个时期对花青素和多糖生物合成产生影响的相关环境因素会直接影响到当年黑果枸杞果实的品质，这也为以后的生产实践提供了重要的理论研究基础。相比之下，遮光处理的黑果枸杞在其他几个时期果实内花青素和多糖含量的变化都不明显。殷培蕾等人在研究中提到，光照对苦荞芽中多酚类物质及抗氧化活性均有重要影响[29]；但在本研究中发现，遮光对黑果枸杞多酚积累并没有显著影响，对于检测中没有显著影响的几个结果，可能因为对遮光处理的时间和方法把握不准确，结论有一定的局限性。因此，下一步我们会在此次研究结果的基础上对遮光处理的时间和方法进行改进，包括对黑果枸杞果实内的多酚类型和含量作进一步的测定分析以及设置遮光时长梯度和遮光程度变化等，进一步确定光照影响黑果枸杞果实中有效活性成分积累的关键时期，从而为下一步对光诱导果实内有效活性成分深层机理的揭示和珍稀资源特异种质的合理利用及遗传育种奠定重要理论基础。

综上所述，光照可能是影响黑果枸杞果实品质优良的决定性环境因素之一，遮光处理显著降低了黑果枸杞的营养价值和果实品质，与正常生长条件下的果实相比，表现出明显的差异，这为以后对黑果枸杞的良种化培育和人工规模化栽培以及保护和持续利用这一宝贵资源提供了理论依据。