黑暗条件下褪黑素对栀子叶片类黄酮含量及相关基因表达水平的影响

王 荣 成梦琳 刘慧娜 赵大球 陶 俊

(扬州大学园艺与植物保护学院，扬州 225009)

叶片衰老本质上是一种程序性死亡，典型症状是叶片发黄[1]。目前，国内外对叶片变色的研究主要集中在色素的变化[2]、叶片微观结构[3]、内在遗传[4]、生态因子的影响[5]等方面。其中，在高等植物中，引起叶色变化的直接原因主要是叶片内的叶绿素、类胡萝卜素、类黄酮等色素含量的变化[6]，如绿叶树种中呈现绿色的叶绿素含量较高，而彩叶树种中类黄酮类色素含量较高。在生态因子中，光照由于影响植物叶片中的光合作用[7]，因此是影响叶片中色素变化的主要因子，光照的强度以及光照时间的长短都会影响植物叶色的变化。在前人的研究中，当叶片黄化，常常通过改善栽培管理条件[8]以及添加外源物质如激素等[9]来缓解叶片变黄。

栀子(GardeniajasminoidesEllis)为茜草科(Rubiaceae)栀子属(Gardenia)的多年生常绿灌木[10]。栀子原产于中国，距今已有2000多年栽植历史，又因其叶片翠绿、花香浓郁，被广泛种植于亚洲其他国家和地区，是绿化和美化环境的优良树种[11]。近年来，在世界花卉市场中，切叶类产品发展迅猛，切叶与切花的需求量比例日益升高，栀子叶片因其叶色苍翠、叶形优美等优点而备受青睐，常被用作花束的配材。然而，作为切花配材，栀子叶片在运输途中，或作为室内瓶插时，常常面临光线不足的问题，导致叶片黄化，严重影响了其观赏效果。褪黑素是一种重要的吲哚衍生物，化学名称为N-乙酰基-5-甲氧基色胺[12]，广泛存在于动物与人体内，是一种作用力极强的内源性自由基清除剂，具有增强免疫力、延缓细胞衰老和抗癌等作用[13]。近年来，随着在植物体内的发现，褪黑素对植物体的生理功能成为研究的热点。研究者们发现，作为一种强大的自由基清除剂，褪黑素在植物体内具有抗氧化伤害[14]、抗低温胁迫[15]、抗盐胁迫[16～17]、减轻重金属危害[18]等重要作用。本课题组前期研究发现，在极度弱光(黑暗)的条件下，应用褪黑素能够有效缓解栀子叶片的黄化，然而关于栀子叶片变黄是由哪类色素调控的机制并不清楚。因此在前期研究的基础上，本文采用转录组测序和液相色谱技术研究了黑暗条件下栀子叶片类黄酮类色素变化，旨在探明外源褪黑素对黑暗条件下栀子叶片类黄酮含量的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

本实验选用栽植于江苏省扬州大学文汇路校区(32°39′N,119°43′E)的栀子成熟叶片为材料。采集生长健壮、粗细均匀、无病虫害的一年生半木质化的栀子枝条，采下后用保鲜袋装好并保湿带回实验室，先后在自来水和无菌水下冲洗5分钟，叶柄放入双蒸水下统一剪去1 cm左右防止气栓，使用吸水纸将叶片表面水分吸干。随后将茎用脱脂棉包裹，分别插入含有双蒸水和浓度为1.0 mmol·L-1的褪黑素溶液中，处理完后放入黑暗25℃恒温培养箱中，设置相对湿度60%。每日18:00～19:00更换1次溶液，持续处理24 d后采集叶片测定色泽指标，而后立即用液氮处理并在-80℃冰箱中保存。

1.2 方法

1.2.1 色泽指标测定

使用便携式色差仪RM200QC(X-Rite，瑞士)测定叶片的色泽指标。

1.2.2 转录组测序与数据分析

将对照和经褪黑素持续处理24天后的叶片提取的总RNA用于转录组测序研究，由华大基因公司构建了6个文库(对照和褪黑素处理各1个，3个重复)，使用Illumina HiSeqTM2000平台(Illumina Inc.，San Diego，CA，USA)进行测序。参照Audic等人[19]的方法，基于两个样品之间的倍数差异大于等于2倍(即|log2 Control/Melatonin treatment|>l)，调整P≤0.05筛选两个样品间的差异表达基因(DEGs)。对筛选出来的DEGs进行GO功能富集分析和KEGG代谢通路富集分析，用来了解DEGs的生物学功能及参与的代谢途径。

1.2.3 基因表达水平分析

采用实时定量PCR(qRT-PCR)技术分析类黄酮相关基因的表达水平。在测序文库中查找相关基因的序列，并使用primer 5.0设计引物，由生工公司合成。使用PrimeScript® RT reagent Kit With gDNA Eraser试剂盒(TaKaRa,日本)将栀子叶片RNA反转录成cDNA第一链。以栀子Actin基因作为内参(表1)。使用SYBR®Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)(TaKaRa，日本)进行qRT-PCR，其反应体系为：12.5 μL SYBR®Premix Ex TaqTM(2×)、0.5 μL PCR Forward Primer、0.5 μL PCR Reverse Primer、0.5 μL Rox Reference DyeⅡ(50×)、2 μL cDNA模板、9 μL ddH2O，反应条件为：50℃反应2 min，95℃反应5 min，另95℃变性15 s，51℃退火15 s，72℃延伸40 s进行40个循环。通过2-△△CtCt(comparative threshold cycle)方法计算基因相对表达水平。使用Bio-Rad CFX Manager V1.6.541.1028软件收集一式三份反应的Ct值。

表1 qRT-PCR特异性引物Table 1 qRT-PCR special primers

1.2.4 类黄酮含量测定

使用芦丁标准品，用色谱纯甲醇溶液将标准品母液逐级稀释，配制成一系列质量浓度的混合标准品溶液(0.625、1.25、2.5、5、10和20 mg·L-1)。样品提取液为CH3OH∶H2O∶HCl为70∶29.9∶0.1。

色谱柱为TSK gel ODS-80Ts QA(4.6 mm×250 mm)(Tosoh,日本)；流动相A：10∶90；HCOOH∶H2O；流动相B：10∶40∶50；CH3OH∶CH3CN∶H2O；by volume；流动相流速：0.8 mL·min-1；检测波长：黄酮和黄酮醇，350 nm；花青素，520 nm；并对每个吸收峰从200～800进行全波长扫描；柱温：35℃；进样量：20 μL；洗脱梯度为：0 min，10%B；30 min，20%B；50 min，30%B；60 min，40%B；65 min，50%B；70 min，50%B；75 min，10%B；90 min，10%B。按上述色谱条件，吸取各浓度混合标准品溶液(0.625、1.25、2.5、5、10和20 mg·L-1)分别进样20 μL，以标准品质量浓度为横坐标，积分峰面积为纵坐标绘制标准曲线，计算出标准曲线的线性回归方程和相关系数，按照线性回归方程，通过各样品的峰面积计算出所含类黄酮的含量。

1.2.5 数据处理与分析

所有实验均重复3次，完全随机化设计。实验数据处理分析、制表使用SAS(6.12版，SAS Institute，Cary，NC，美国)完成，图片处理整合用Sigmaplot、Heatmap illustrator、Photoshop软件完成。

2 结果与分析

2.1 褪黑素对叶片色泽的影响

如图1所示，在黑暗条件下处理24 d后，对照组叶片显著变黄，而经褪黑素处理的叶片明显保持绿色。此外，使用色差仪测量的色泽相关指标也呈现出一致的结果。如图2所示，对照组中L*值显著高于处理组，表明对照组的叶片亮度高于处理组，而黄色亮度高于绿色；a*值代表红色至绿色的范围，两组均为负值，均表现出绿色，而处理组负值更小，说明处理组中表现出更明显的绿色；b*值代表从黄色至蓝色的范围，对照组b*值显著高于处理组，说明对照组表现出更明显的黄色；c*值代表色彩饱和度，对照组的c*值显著高于处理组，说明颜色更鲜明。

2.2 转录组测序数据质量评估

将测序得到的原始测序序列(Raw reads)去除低质量序列后，我们分别从对照组3个重复中获得44.61、44.57和44.28 Mb序列(cleans reads)，相对应的总碱基数(Total Clean Bases)有6.69、6.69和6.64 Gb；而褪黑素处理样品中cleans reads分别为44.28、44.53和44.44 Mb，Total Clean Bases为6.64、6.68和6.67 Gb。从整体上看，质量值小于20的碱基比例较低，说明测序质量较好。

图1 褪黑素对黑暗条件下栀子叶片色泽的影响Fig.1 The effect of melatonin on the color of dark-induced Gardenia leaf

图2 褪黑素处理对黑暗条件下栀子叶片色泽指标的影响Fig.2 Effect of melatonin treatment on the color indices of dark-induced Gardenia leaf

2.3 差异表达基因的筛选与分析

通过比较不同样本间的表达量，共获得了2 354个DEGs，其中上调基因782个，下调基因1 572个。根据差异基因检测结果，我们对其GO功能进行分类与富集分析。GO可分为分子功能、细胞组分和生物学进程三大功能类，我们对三大功能类单独进行进一步的分类以及富集分析。在分子功能分类中，DEGs在催化活性(catalytic activity)和蛋白结合(binding)功能中所占比例最高；在细胞组分分类中，DEGs在细胞(cell)和细胞部分(cell part)功能中所占比例最高；在生物学进程分类中，DEGs在代谢过程(metabolic process)和细胞过程(cellular process)功能中所占比例最高。为进一步了解DEGS的生化代谢和信号转导途径，通过比对KEGG数据库获得了DEGs显著富集pathway，共有1 021个DEGS注释到131个路径中，其中代谢途径最多，为489个(ko01100)，其次是次生代谢产物为318个(ko01100)及淀粉和蔗糖代谢途径114个(ko00500)。在此基础上，这些途径又被分为碳水化合物代谢、氨基酸代谢、脂质代谢、色素生物合成等。从中我们发现了与色素合成最为密切的显著性富集pathway，比如类黄酮生物合成、异黄酮生物合成、黄酮和黄酮醇生物合成等，表明类黄酮是栀子叶片变黄的主要物质因素。

图3 差异基因表达模式热图Fig.3 Heat map of the main DGEs expression patterns

在类黄酮的相关合成途径中，筛选到4个在类黄酮生物合成途径中的基因，分别为类黄酮3′羟化酶基因(flavonoid 3′-hydroxylase gene，F3′H)、类黄酮3′,5′-羟化酶基因(flavonoid 3′,5′-hydroxylase gene，F3′,5′H)、莽草酸-羟肉桂酰基转移酶基因(shikimate O-hydroxycinnamoyltransferase gene，HCT)、黄酮醇合酶基因(flavonol synthase gene，FLS)；4个在异黄酮生物合成途径中的基因，分别为类黄酮6-羟化酶基因(flavonoid 6-hydroxylase gene，F6H)，2-羟基异黄酮脱水酶基因(2-hydroxyisoflavanone dehydratase gene，HID)，异黄酮7-O-葡萄糖苷-6″-O-丙二酰转移酶基因(isoflavone 7-O-glucoside-6″-O-malonyltransferase gene，IF7MaT)和异黄酮2′-羟化酶基因(isoflavone 2′-hydroxylase，I2′H)；3个在黄酮和黄酮醇生物合成中的基因，分别为F3′,5′H，F3′H和IF7MaT，其中F3′,5′H和F3′H同时参与异黄酮生物合成途径和黄酮和黄酮醇生物合成途径，IF7MaT同时参与类黄酮生物合成途径和黄酮和黄酮醇生物合成途径。从图3中我们能够看出，这些基因均在褪黑素处理叶片中下调表达，表明褪黑素抑制了栀子叶片中类黄酮相关基因在黑暗条件下的表达。

2.4 候选基因表达水平的qRT-PCR验证

为了验证转录组测序的结果，我们通过qRT-PCR来检测部分候选基因的表达水平，结果如图4所示，随机选择的HID、HCT、FLS、F3′H、IF7MAT和F6H基因在对照中的表达水平均高于其在褪黑素处理叶片中的表达水平，并且它们的表达趋势与通过转录组测序获得的结果基本一致，这表明转录组测序的结果准确、可靠。

图4 qRT-PCR与测序结果相对表达水平比较Fig.4 Comparison of relative expression levels between qRT-PCR detection and transcriptome sequencing results

图5 栀子叶片中类黄酮含量测定的液相色谱峰图Fig.5 Liquid chromatograms of detected flavonoid content in Gardenia leaf

2.5 叶片中类黄酮含量测定

为了验证转录组测序结果关于类黄酮与叶片黄化的相关性，我们采用液相色谱法测定了样品中黄酮和黄酮醇以及花青素的的含量。图5A为波长520 nm检测出的对照组和处理组的液相色谱峰图，可以看出并未检测出明显峰。图5B为波长350 nm检测的峰图，出峰明显，同时可以发现两者出现的峰基本一致，并且褪黑素处理的峰面积均小于对照。通过对含量的统计，发现对照叶片中类黄酮含量明显高于褪黑素处理的叶片(图6)。

图6 褪黑素处理对黑暗条件下栀子叶片类黄酮含量的影响Fig.6 Effect of melatonin treatment on flavonoid content of dark-induced Gardenia leaf

3 讨论

类黄酮物质广泛存在于植物叶片中[20]，是存在范围最广的一种次级代谢物质[21～22]，具有重要的生物活性[23]。类黄酮包括水溶性的花青素、黄酮和黄酮醇，在自然界中，它们与各种类型的糖结合，以糖苷的形式存在，参与植物颜色的形成，使植物呈现黄色、红色、蓝色等颜色[24]。类黄酮的生物合成途径来自于苯丙烷代谢支路，苯丙氨酸是类黄酮类色素合成的直接前体，整个合成过程中共经过3个阶段，第一阶段中苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶(PAL)的作用下合成香豆酰CoA，第二阶段中香豆酰CoA在查尔酮合成酶(CHS)和查尔酮黄烷酮异构酶(CHI)的催化下合成二氢黄酮醇，第三阶段中F3′H和F3′,5′H催化二氢黄酮醇合成花色素苷的前体[25]。

在本研究中，我们在类黄酮类色素合成相关途径中共筛选出了8个基因，其中F3′H和F3′,5′H参与类黄酮生物合成过程的第三阶段，在类黄酮合成代谢中的功能也比较明确。F3′H是类黄酮代谢中关键酶[26]，它能催化柚皮素(naringenin)和二氢堪非醇(dihydrokaempferol DHK)生成圣草酚(eriodictyol)和二氢栎皮黄酮(dihydroquercetin,DHQ)[27～28]。F3′,5′H催化二氢栎皮黄酮生成二氢杨梅黄酮(DHH)，同时也能直接催化二氢堪非醇生成二氢杨梅黄酮[29]。关于HCT基因的研究主要集中在木质素的生物合成，HCT是苯丙烷代谢下游木质素合成途径中的关键酶[30]，Hoffman等研究发现HCT酶基因主要控制木质素G/S-单体的生物合成，通过调节HCT的表达可以达到降低木质素的含量的目的[31]。Lepelley等通过研究发现HCT和G型和S型木质素合成前体绿原酸的合成有关，它能催化莽草酸与香豆酸和咖啡酸成酯[32]。黄酮醇生物合成是类黄酮化合物代谢途径的一个重要的分支，黄酮醇也是黄酮类物质中重要的一类，除具有正常的生理功能外，还可以作为叶色、花色、果色的重要辅色因子[33]，研究表明FLS在黄酮醇类化合物的代谢中起到重要的作用，二氢黄酮醇在FLS的催化下转变成黄酮醇苷元，然后在尿苷二磷酸糖基转移酶(UGTs)催化下进行糖基化等修饰，形成稳定多样的黄酮醇衍生物，FLS与F3′H和F3′,5′H都是黄酮醇生物合成的重要酶[34]。在植物类黄酮合成途径中，只有少数酶具有6-位羟化作用[35]，关于F6H基因的研究还不够充分，Anzellotti and Ibrahim研究发现金腰属植物中的F6H催化甲基化的黄酮醇6-位羟化[36]，Latunde-Dada等在大豆中发现F6H对黄酮也有一定的催化作用[37]，Berim等发现在两种唇形科植物甜罗勒和薄荷中的F6H是以7-O-甲基化芹菜素为底物，被CYP82D家族的单加氧酶催化合成[38]。异黄酮合酶(Isoflavone synthase，IFS)是异黄酮生物合成代谢中的关键酶[39]，Kochs等[40]和Hashim等[41]分别在大豆和三裂葛悬浮微粒细胞体中研究证明了黄烷酮到异黄酮共经过两步反应，第一步IFS酶催化柚皮素生成了2-羟基异黄酮，第二步HID催化2-羟基异黄酮脱水成大豆苷元和染料木素[42]。Koester等[43]发现异黄酮共轭3是经过IF7GT的作用与IF7MaT的作用合成的。I2′H属于细胞色素P450 81E家族，能够催化合成2′羟基异黄酮，在植物异黄酮类衍生物合成中起到重要的作用[44]。在本研究中，我们筛选出的与类黄酮合成相关的8个基因在处理组中的表达量均显著低于对照组，同时使用液相色谱测定的类黄酮含量在处理组中显著低于对照组，这表明类黄酮的生物合成被外源性褪黑激素抑制。

褪黑素是一种重要的吲哚胺，普遍存在于植物中[45～46]，具有强抗氧化性，在应对非生物胁迫中发挥着重要的作用[47～48]，但鲜有文献报道褪黑素与色素合成的相关性。在本研究中我们发现，当栀子叶片受到黑暗胁迫时，类黄酮含量上升使叶片呈现明显的黄色，而施加褪黑素的叶片颜色却保持绿色，说明褪黑素对叶色的变化有着重要的作用，这对日后的研究能够提供重要的方向。

总体而言，在黑暗条件下处理24 d后，处理组的叶片明显变黄，而褪黑素处理叶片依旧保持绿色，叶片越黄，亮度越高，色彩饱和度越强。通过转录组测序筛选出与类黄酮合成相关差异表达基因，均在对照组中上调表达，加之液相色谱的测定也证实了对照组中的类黄酮含量高于处理组，这表明褪黑素能够抑制类黄酮的合成。目前关于褪黑素与色素调控方面的研究还较少，有待今后进一步的研究与验证。