荞麦蜜中的多酚类成分与蛋白复合物

赵宏玉，孙娅楠，张根生，乔江涛，张红城

(1.哈尔滨商业大学，黑龙江哈尔滨 150010； 2.深圳出入境检验检疫局，广东深圳 518045；3.中国农业科学院蜜蜂研究所，北京 100093)

人类食用蜂蜜的历史可以追溯到史前时期，主要是用作甜味剂[1-2]。最近有研究表明，蜂蜜具有抗氧化、抗菌、抗炎等多种生物学功能，这些功能的产生来源于其本身的物理化学特性[3]，包括蜂蜜中的糖、矿物质、多酚、蛋白质、氨基酸及经由葡萄糖氧化产生的过氧化氢等[4-5]。多酚具有独特的可以在相互之间或与其他分子之间形成复合物的能力，其中最主要的特性就是与蛋白质亲和，这也导致许多可溶或不可溶复合物的形成[6]，而蜂蜜中多酚类化合物是否与蛋白质发生复合尚不明确。

中国是蜂蜜生产大国，荞麦蜜是我国重要的单花蜜之一，是一种具有独特麦芽香味的深色蜜。有研究发现，在不同种类来源的单花蜜中，荞麦蜜的抗氧化活性和氧自由基吸收能力(ORAC)相对最强[7]，且多酚类物质含量十分丰富[8]。本试验通过探讨荞麦蜜中是否存在多酚-蛋白质复合物及与多酚类化合物结合的蛋白质种类，旨在引导人们关心蛋白质和多酚相互作用的重要性及蜂蜜中这种复合物的营养学和生物学功能。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

1.1.1 试验材料 荞麦蜜样品，2016年产自内蒙古，存放于4 ℃冰箱中。

1.1.2 试剂 三氯化铝、碳酸钠、氢氧化钠、氯化钠、三氯乙酸、三氟乙酸、乙腈、丙酮、甲酸等，均为分析纯，购自北京化学试剂公司；考马斯亮蓝G-250、碘乙酰胺，购自北京索莱宝科技有限公司；甲醇，购自美国Fisher公司；98%没食子酸、芸香苷对照品，购自上海佳和生物科技有限公司；福林-酚试剂，购自北京康为世纪生物科技有限公司；Novex®4-12% Tris-甘氨酸凝胶、2×上样缓冲液、10×Tris-甘氨酸电泳缓冲液、20～1 200 ku 非预染蛋白marker，购自美国英杰生命技术有限公司。

1.1.3 主要仪器与设备 微量移液器，由德国艾本德(上海)国际贸易有限公司生产；AL204型分析天平，由梅特勒-托利多仪器有限公司生产；Easy-nLC 1000系统耦合Orbitrap Fusion质谱仪、Sorvall Biofuge Startos型台式离心机，由美国赛默飞(中国)有限公司生产；SHB-Ⅲ型循环水式真空泵，由长城科工贸有限公司生产；DZF-6090型真空干燥箱，由上海一恒科学仪器有限公司生产；超纯水系统，由美国密理博公司生产；KQ-50DB型数控超声波清洗器，由昆山市超声仪器有限公司生产；Amicon Ultra 3KD超滤管、PROTEAN等电聚焦电泳仪、Mini-Protein Ⅱ垂直板电泳装置、电泳图像扫描仪，由美国Bio-Rad公司生产；XCell SureLock®Mini-Cell蛋白垂直电泳槽，由美国英杰生命技术有限公司生产；TS-2型脱色摇床，由江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司生产；F-4600荧光分光光度计，由日本日立公司生产；2080TW型LG微波炉，由LG电子(天津)电器有限公司生产。

1.2 方法

1.2.1 多酚与蛋白复合物提取液的制备 在荞麦蜜加入 2 mol/L NaCl配制成蜂蜜水，经3 ku超滤管超滤，于 12 000 r/min 离心15 min，分别得到滤出液、截流液2个组分，置于4 ℃冰箱中保存。

1.2.2 荞麦蜜中总酚含量的测定 以没食子酸为对照品，采用福林-西奥卡特(Folin-Ciocalteu)法建立总酚含量的标准曲线；未经氯化钠处理和经氯化钠处理的蜂蜜水均用3 ku超滤管超滤，各取0.2 mL，采用福林-西奥卡特(Folin-Ciocalteu)法测定，以没食子酸相对含量表示总酚含量，重复3次。

1.2.3 荞麦蜜提取物中总黄酮含量的测定 以芸香苷为对照品，采用三氯化铝(AlCl3)法建立总黄酮的标准曲线；未经氯化钠处理和经氯化钠处理的蜂蜜水均用3 ku超滤管超滤，各取0.2 mL进行测定，用芸香苷相对含量表示样品中的总黄酮含量，重复3次。

1.2.4 荞麦蜜样品三维(3D)荧光光谱的全波长扫描 将荞麦蜜配制成蜂蜜水，经3 ku超滤管超滤，于12 000 r/min离心15 min，分别得到滤出液、截流液2个组分，用3D荧光光谱测定，测定条件：激发起始波长200.0 nm、激发终止波长 700.0 nm、激发采样间隔10.0 nm，发射起始波长210.0 nm、发射终止波长 710.0 nm、发射采样间隔10.0 nm，扫描速度30 000 nm/min，激发狭缝5.0 nm，发射狭缝5.0 nm，电压 400 V，响应值为自动。

1.2.5 非变性凝胶电泳(Native-PAGE)结合液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)检测蜂蜜样品中的蛋白 选取大于3 ku的组分，采用4%～12%Tri-甘氨酸预制凝胶进行电泳，恒压125 V，电泳时间3 h，上样量5 μL；用考马斯亮蓝G-250染色，低火微波1 min，再在摇床上染色5 min；用脱洗液脱色至背景干净、蛋白条带清晰；取Native-PAGE胶上的条带进行脱盐处理用于胶内酶解：样品用25 mmol/L二硫苏糖醇(DTT)还原二硫键，用55 mmol/L碘乙酰胺烷基化，再用测序级改性的胰蛋白酶用50 mmol/L碳酸氢铵于 37 ℃ 处理12 h以达到分离胶消化；所得到的肽段在50%乙腈水溶液中用1%三氟乙酸提取2次，真空离心，蒸发浓缩器浓缩；将处理好的肽段进行质谱分析，质谱条件：100 mm×2 cm、3 μm Acclaim PepMap C18色谱柱分离，以300 nL/min流速运行 60 min 梯度洗脱，流动相A为水并含有0.1%甲酸，流动性B为乙腈并含有0.1%甲酸，350～1 550m/z、分辨率 120 000 进行全扫描；离子阱二级质谱扫描，使用自带的蛋白质谱搜库软件(Version PD1.4)对UniProtKB/Swiss-Prot数据库进行搜索匹配。

2 结果与分析

2.1 荞麦蜜样品中的总酚和总黄酮含量

试验结果表明，未经NaCl处理和经NaCl处理荞麦蜜水溶液的滤出液中总酚和总黄酮含量有一定差异，未经NaCl处理的荞麦蜜总酚、总黄酮含量分别为(1 742.1±63.6)、(23.5±5.3) mg/kg，经2 mol/L NaCl处理的荞麦蜜总酚、总黄酮含量分别为(2 723.8±41.3)、(28.7±6.4) mg/kg，经 2 mol/L NaCl处理的蜂蜜水滤出液总酚含量明显高于未经处理的，这可能是由于蜂蜜经2 mol/L NaCl水溶液处理后，破坏了蛋白和多酚二者之间的非共价键，使复合的多酚游离出来，经超滤后多酚与蛋白分离，使得小于3 ku的多酚含量升高；荞麦蜜经NaCl处理前后的样品总黄酮含量相差很小，为 5.2 mg/kg，说明蜂蜜中主要是多酚和蛋白发生复合，而不是黄酮。

2.2 荞麦蜜样品3D荧光光谱全波长扫描结果

3D荧光光谱是近些年来在荧光光谱分析基础上发展起来的一种荧光分析技术[9]，与普通的荧光光谱分析方法相比，3D荧光光谱法具有能够获得激发波长λex与发射波长λem同时变化时的荧光强度信息的优点，可以提供在普通发射谱中得不到的信息[10]，能够提供荧光强度、荧光偏振等物理参数，进而了解蛋白质分子中荧光生色基团所处的微环境，有助于阐述蛋白质的结构与功能[11]，成为研究其他物质与蛋白质相互作用的主要手段[12]。有研究表明，蛋白质的激发波长为280 nm，发射波长为305～354 nm[13]，多酚类物质的激发波长为 330～385 nm，发射波长为420～485 nm[14]。由图1可知，未经NaCl处理的荞麦蜜有2个峰，第1个位置为λex=276～283 nm、λem=313～324 nm，表明样品中存在蛋白成分；第2个位置为λex=335～368 nm、λem=420～464 nm，表明样品中存在多酚成分。由图2、图3可知，NaCl处理的荞麦蜜经超滤后小于3 ku的组分中只有1个峰，λex=353～367 nm、λem=431～468 nm，表明样品中只存在多酚成分；大于3 ku的组分中有2个峰，对应的λex=347～378 nm、λem=429～476 nm和λex=271～289 nm、λem=305～346 nm，说明该组分中既有多酚类化合物又有蛋白，这是由于游离态的多酚成分分子量不可能大于3 ku。因此可以推测，组分中大于3 ku的多酚类物质是以多酚和蛋白的复合物形式存在的。

2.3 Native-PAGE和LC-MS/MS分析荞麦蜜中的复合蛋白

2.3.1 Native-PAGE分析 由图4可知，蜂王浆主蛋白1提取液(F)分别在620、290、66 ku附近有明显的条带，处理后大于3 ku的荞麦蜜超滤液2个重复组分M1、M2在620、290、66 ku附近也有明显的条带出现，且条带位置均略高于F组分，说明荞麦蜜大于3 ku的组分中可能是蜂王浆主蛋白1，并且是以复合物形式存在的。

2.3.2 LC-MS/MS质谱鉴定结果 分别选取Native-PAGE电泳中N1～N6胶进行胶内酶解，利用LC-MS/MS对其蛋白进行鉴定，以进一步确认荞麦蜜中与多酚类物质复合的蛋白质种类。由表1可知，N1组分与蜂王浆主蛋白1(MRJP 1_ApismelliferaL.)的序列覆盖率为73.15%，鉴定得到的肽段数为33个；N2组分与MRJP 1_ApismelliferaL.、MRJP 3_ApismelliferaL.的序列覆盖率分别为75.23%、54.41%，鉴定得到的肽段数分别为38、27个；N3组分与MRJP 1_ApismelliferaL.、MRJP 2_ApismelliferaL.的序列覆盖率分别为 86.57%、66.37%，鉴定得到的肽段数分别为38、25个；N4组分与MRJP 1_ApismelliferaL.、MRJP 2_ApismelliferaL.的序列覆盖率分别为83.56%、71.02%，鉴定得到的肽段数为34、29个；N5组分与MRJP 1_ApismelliferaL.、MRJP 2_ApismelliferaL.的序列覆盖率分别得为55.09%、67.36%，鉴定得到的肽段数分别为24、27个；N6组分与MRJP 1_ApismelliferaL.的序列覆盖率为67.70%，鉴定得到的肽段数为30个。因此推测，荞麦蜜中的蛋白主要由MRJP 1_ApismelliferaL.、MRJP 2_ApismelliferaL.、MRJP 3_ApismelliferaL.组成的。从生物信息学比对结果看，确定荞麦蜜大于3 ku组分中的蛋白为MRJP 1_ApismelliferaL.。

表1 LC-MS/MS鉴定荞麦蜜中的蛋白种类

3 结论

通过测定荞麦蜜中总酚含量、3D荧光光谱及Native-PAGE、LC-MS/MS质谱分析，确认荞麦蜜中存在多酚与蛋白复合物，且多酚类成分是与蜂王浆主蛋白1(MRJP 1_ApismelliferaL.)结合的，这为蜂蜜中复合物营养学和生物学功能的进一步研究提供了理论参考。