褐牙鲆幼鱼耳石上的外源Sr标记试验

李 爽，李 耕，潘玉洲，张 力，申旭东，李忠红，郑文军，杨文波，袁立来，姜 涛，杨 健

(1.中国水产科学研究院营口增殖实验站，辽宁营口 115004； 2.中国水产科学研究院，北京 100039；3.中国水产科学研究院淡水渔业研究中心/院长江中下游渔业生态环境评价与资源养护重点实验室，江苏无锡 214081)

耳石是硬骨鱼类内耳中的一种硬组织，作为一种生物矿物伴随着鱼类生长的同时，其能以微化学“指纹”或者微结构特征等形式记录鱼类生活史过程中的全部生境履历信息[1-3]。鱼体生长环境的水化学特征的变化导致耳石组成元素发生变化，从而形成耳石上的元素环带X射线电子探针微区分析技术(EPMA)能够快速分析固相介质表面的元素种类及含量，具有测试精度高、检测点密度大、能保持耳石样品信息完整等优点，为相应元素的检测分析提供技术保障[4]。由于在不同盐度水体中鱼类耳石上源自生境的锶(Sr)元素沉积水平差异明显，因此利用耳石上Sr含量和Sr/Ca的值等指标具有有效推演鱼类生活史、重建水体环境变化、识别不同种群的潜力[5-8]。除此之外，利用耳石生长的一些特性(如从受精卵开始耳石即开始形成、一旦形成后不会发生重吸收现象等)，外源Sr标记技术也日益受到重视。然而，我国目前海水鱼类耳石外源Sr标记技术尚有待系统研究。

褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)别称牙片、偏口、比目鱼，是冷水性、底栖的名贵海产经济鱼类，是北方沿海重要的海水增养殖鱼类之一。褐牙鲆个体大、肉质细嫩鲜美、营养丰富、蛋白质含量高、易于消化，是做生鱼片的好材料，深受消费者的喜爱，市场十分广阔，经济价值很高。牙鲆曾在我国的渔业史上占有重要地位，20世纪七八十年代褐牙鲆的捕获量为 2 000 t/年。近二三十年来，由于过度捕捞和环境污染造成自然资源大幅度下降，中国牙鲆人工繁育的研究开始于1959年，20世纪70年代才进入苗种生产研究，1992年以后牙鲆人工养殖发展迅速，目前山东、辽宁、河北、江苏、浙江等地都开展了牙鲆的人工养殖，除了开展网箱养殖和池塘养殖外，正在大力发展大规模的工厂化养殖，并取得了很好的经济效益和社会效益[9]。增殖放流在牙鲆资源的恢复中起到重要作用，探寻一种高效、稳定、安全的标记方法显得尤其重要。本研究尝试通过对褐牙鲆幼鱼阶段添加外源Sr，并利用EPMA检测Sr在耳石上的沉积情况，一方面分析外源Sr标记技术在海水鱼放流标记工作方面的可行性，另一方面尝试探讨褐牙鲆外源Sr标记的最佳标记浓度。相关研究结果不仅可为拓展海水鱼类耳石外源Sr标记技术提供一个重要的实例，同时也可为褐牙鲆放流标记探寻一种更加客观而有效的途径。

1 材料与方法

1.1 材料与试验设计

2016年4月本研究在中国水产科学研究院营口增殖实验站望海科研试验基地进行，试验鱼为实验站望海试验基地人工孵化后的仔鱼，培育50 d后再开始试验，配置不同外源SrCl2·6H2O(天津市大茂化学试剂厂)浓度0、8、12、16、20 mg/L 等5组。试验方案是每组2个平行，共10个养殖水槽。1号组对应0，2号组对应8 mg/L，依次类推至5号组对应20 mg/L。将提前配置不同外源Sr浓度养殖用水放入对应标志的养殖水槽中，并分别放入健康鱼苗30尾。浸染20 d，各组换水2次/d，换入水为对应浓度Sr换水换水量为100%，吸底2次/d，投饵2次/d，饵料为新鲜的卤虫，20 d后在自然水体中恢复养殖20 d，操作方法与前期相同，恢复养殖20 d后每组随机取5尾送检。耳石分析测试在中国水产科学研究院淡水渔业研究中心进行。

1.2 样品采集、处理与分析

采样后在解剖镜下将矢耳石取出，清洗后晾干，置于培养板中备用。耳石先包埋，待树脂凝固后取出，用AB胶将其粘贴于载玻片上，使用500目砂轮和1 200目砂纸打磨耳石至核心即将暴露后，使用磨抛机装备机抛光，至耳石表面无明显划痕；样品放入Milli-Q水中超声清洗5 min后，自然条件下晾干24 h；完全干燥后，使用真空镀膜机蒸镀碳膜。

该研究利用电子微探针分析仪进行定量线分析和面分布分析。参考Yang等的方法[10-11]，从耳石核心沿耳石最长径至边缘连续测定Sr、Ca含量。

数据处理利用Excel 2007软件进行线分布分析中的平均值和倍数计算以及Sr/Ca的值变化作图。耳石中的锶含量远小于钙含量，按惯例Sr/Ca经过标准化的比值，即(Sr/Ca)×103[11]。

1.3 仪器和设备

磨抛机(LaboPol-35，丹麦Struers公司)；真空镀膜机(JEE-420，日本电子株式会社)；电子微探针分析仪(JXA-8100型EPMA，日本电子株式会社)。

1.4 数据处理

利用Excel 2007软件进行线分布分析中的平均值和倍数计算以及Sr/Ca值变化作图，采用SPSS 17.0软件进行不同阶段及与对照组的Sr/Ca值差异显著性分析，显著性水平设定为0.05。耳石中的锶含量远小于钙含量，按惯例Sr/Ca经过标准化的比值，即(Sr/Ca)×103[11]。

2 结果与分析

2.1 外源Sr在褐牙鲆耳石上线分析的Sr/Ca值

由图1和表1可知，空白组即0 mg/L组试验鱼的耳石 Sr/Ca 的值变化不明显，而8～20 mg/L组试验鱼的耳石 Sr/Ca 的值变化十分明显，根据图2不同色区的分布可大致将试验鱼的生长分为3个色区阶段。8 mg/L组第一阶段的色区为从耳石核心沿矢状边缘方向的0～440 μm范围，Sr/Ca的值与空白组基本一致；第二阶段的色区为从耳石核心沿矢状边缘方向的440～870 μm范围，Sr/Ca的值基本达到最高；第三阶段的色区从耳石核心沿矢状边缘方向的870 μm至耳石最长轴边缘，其Sr/Ca的值逐渐降低并逐渐趋向第一阶段的Sr/Ca的值。12 mg/L组第一阶段的色区平均为0～350 μm 范围，Sr/Ca的值与空白组基本一致；第二阶段的色区平均在350～670 μm范围，Sr/Ca的值基本达到最高；第三阶段的色区平均为670 μm至耳石最长轴边缘，Sr/Ca的值逐渐降低并逐渐趋向第一阶段的Sr/Ca的值。16 mg/L组第一阶段的色区平均为0～390 μm范围，Sr/Ca的值与空白组基本一致；第二阶段的色区平均为390～670 μm范围，Sr/Ca的值基本达到最高；第三阶段的色区平均为670 μm至耳石最长轴边缘，Sr/Ca的值逐渐降低并逐渐趋向第一阶段的色区。20 mg/L组平均第一阶段的色区平均为0～350 μm范围，Sr/Ca 的值与空白组基本一致；第二阶段的色区平均为350～720 μm范围，Sr/Ca的值基本达到最高；第三阶段色区平均为720 μm至耳石最长轴边缘，Sr/Ca的值逐渐降低并逐渐趋向第一阶段的Sr/Ca的值。

不同浸染浓度Sr/Ca的值微化学变化详细信息见表1，经外源Sr2+干扰后，可将耳石Sr/Ca分为明显的3个阶段。其中，第一阶段的Sr/Ca均值与对照均无显著差异，处理组第二阶段的Sr/Ca均值、峰值均显著高于相应的第一阶段(P<0.01)，而比值变动不大的第一阶段与第三阶段没有显著性差异，通过组间比较可以发现16、20 mg/L的Sr峰比较接近，几乎无差异，故利用人工标记时，可适当选择低浓度来降低标记成本。

2.2 外源Sr2+在褐牙鲆耳石上的面分布

由图2所示，褐牙鲆在不同浓度的Sr2+水体中浸染20 d，再恢复到自然水体中再养殖20 d，在耳石上能形成极为明显的红色“高锶环带”，对照组无变化。同时，“高锶环带”明显随着外源水体浓度升高和时间的推移而“变宽”并且恢复至正常水体后，锶环带缓慢从红色经黄色向绿色转变，Sr/Ca的值逐渐降低。表明外源8～20 mg/L浓度的SrCl2·6H2O均能在牙鲆耳石上大量沉积，且锶环带颜色与外源锶浓度呈正相关，在浸染结束后仍能持续向耳石上沉积一段时间，并可恢复至初始水平。

表1 褐牙鲆耳石中锶钙含量比值的变化

3 讨论与结论

EPMA作为一种有效测定固相微区元素成分的技术，在材料科学、矿物学等领域应用广泛[11-13]。近年来，随着对鱼类耳石的生态学意义的不断研究，耳石微化学与鱼类生活史信息间的关系得以论证。因此，EPMA分析技术也被引入到了鱼类生态学研究中，并凭借交叉学科的优势使其在海洋[5]、河口[11]、洄游性[10]鱼类的生境履历反演、产卵场群体的识别[14-15]以及淡水鱼类[16-17]和洄游性鱼类[18]增殖放流标记等方面取得了许多突破性的成果。

通常情况下，鱼类耳石中锶、钙含量的比值与水体盐度具有正相关性[19]，借此可以通过分析耳石上Sr/Ca的值来研究鱼体的生活水环境盐度，进而反演其生境履历信息，讨论其时空分布动态以及群体组成情况等。因此，通过人为控制鱼类的生活水体中的Sr浓度也必然会在耳石上产生印记，这也得到了本研究结果的证实。在20 d浸染试验后，耳石上Sr浓度高峰一直持续到接近边缘，再将其恢复到正常水体养殖20 d后能回到正常水平。从浸染开始时到Sr在褐牙鲆耳石上沉积有延时过程，在含有不同浓度的Sr2+水体中侵染20 d，恢复到正常水体中养殖20 d，而Sr浓度峰区却持续了20 d以上，在正常水体中养殖时，Sr浓度峰区依旧存在，仍能持续向耳石上沉积一段时间。表明Sr元素从水体到耳石的沉积过程是循序渐进的。姜涛等分析刀鲚(Coilianasus)在快速向淡水洄游后耳石Sr/Ca的值也并不能很快下降至淡水水平[17]。在整个试验进程中，试验鱼都能保持正常生长、摄食，未产生明显的应激反应。王臣等在大麻哈鱼耳石Sr标记工作的结果显示，即使在50～400 mg/L这样含量极高的外源Sr条件下，试验鱼依旧未产生明显的应激反应或毒性反应，并且之后耳石上的Sr含量能恢复到正常水平[18]，说明其急性毒性风险也较小。而Sr本身亦作为生物的必需元素[17]，由此可见本研究所用0～20 mg/L外源Sr(SrCl2·6H2O)进行褐牙鲆耳石标记工作应该是安全、可行的。

外源Sr在褐牙鲆耳石上沉积的特点能很好地吻合对鱼类放流标志的要求，使人工控制外源Sr在耳石上做明显的“锶元素标记”成为可能。该标记方法与其他内源性标记方法相比操作简便，利用精密的EPMA技术检测准确，从Sr/Ca高峰的出现而言是很稳定的，应该是我国牙鲆放流标志的新方向。值得注意的是，为今后更好地于褐牙鲆增殖放流标记工作中利用该技术，如何筛选所需标记用Sr的最佳剂量、最佳浸染时间，以及如何去评估Sr富集对于牙鲆水产品安全是否会产生影响等很多问题还需要在下一步的研究中得到有针对性的探讨。