红叶樱花不同采集时期外植体萌芽差异及其原因分析

李艳敏，王利民，董晓宇，师　曼，张　晶，蒋　卉，王慧娟，高　杰，张和臣

(河南省农业科学院 园艺研究所，河南 郑州 450002)

红叶樱花(Prunusserrulata‘Royal burgundy’)属蔷薇科李属红叶落叶乔木，叶片红色，花玫瑰色重瓣，集观花、观叶于一身，是风景园林、城市绿化的名贵观赏彩叶树种。关于樱花的组织培养研究比较多[1-8]，王永清等[1]、冷天波等[2]、及华[3]的研究结论差异较大，可能与外植体取材时间相关。李艳敏等[4]研究发现，在生长季节采集红叶樱花外植体，萌发生长良好;在休眠季节采集的外植体能萌发，但是萌发后生长缓慢，生长势不如生长季节外植体好，组培苗的生长与外植体的取材时期、腋芽休眠和萌发状态密切相关。

木本植物为抵御寒冷侵袭，大多需要经过休眠才能在春季萌发成芽。植物抵御寒冷，进入休眠以及随后解除休眠进入生长发育状态，与内源物质含量变化及其调节机制密切相关。其中，最主要相关的是可溶性糖、可溶性蛋白和植物激素。可溶性糖和可溶性蛋白是植物生长的物质基础，秋冬季节芽休眠时可以提高其抗寒性，春季芽萌发时为其生长提供能量[9-10]；在秋冬季休眠的主要低温期，木本植物的可溶性蛋白及可溶性糖含量均随温度降低呈递增趋势，品种抗寒性越强可溶性蛋白及可溶性糖含量越高[10]。通过低温处理，花芽可溶性糖和可溶性蛋白的含量急速增加，有利于促进休眠诱发花芽的分化[11]。可溶性蛋白的亲水胶体性质强，秋冬休眠时期，通过束缚更多的水分显著增强细胞的持水力，降低细胞结冰温度，减少原生质因寒冷带来的伤害[9]，解除休眠后消耗可溶性蛋白促进各类生理代谢的酶、蛋白质、脂类等物质合成。植物激素在低温胁迫、休眠和解除休眠的过程中也起到非常重要的作用，内源激素赤霉素(GA3)和脱落酸(ABA)参与植物的休眠解除过程，GA3是最为重要的促进休眠解除激素，而ABA则是休眠解除的主要拮抗物，GA3含量和GA3/ABA比值可以作为打破休眠的信号指标[11]。通常认为，细胞分裂素(ZA)和吲哚乙酸(IAA)是促进生长的激素，二者之间存在拮抗作用，共同调控细胞的分化，细胞分裂素与生长素的浓度比值高，可诱导芽形成，解除顶端对腋芽的抑制(即解除顶端优势)，反之则有利于诱导顶端生长优势[12]。因此，可溶性糖、可溶性蛋白及内源激素(主要包括ABA、GA3、IAA和ZA等)含量和比例对木本植物腋芽的休眠、解除休眠、萌发等生理生化过程具有重要的作用。在2016年1—5月进行了红叶樱花外植体取材时期的研究，通过各时期生理指标及其含量的测定，包括可溶性糖、可溶性蛋白、内源激素等，分析各内源物质含量变化规律，结合外植体组织培养萌发结果，探寻红叶樱花腋芽萌芽差异的内源因素，为研究红叶樱花外植体在不同采集时期生理生化差异及其产生原因，确定红叶樱花外植体最佳采集时期提供理论依据，为其他木本植物外植体的采集提供参考。

1　材料和方法

试验于2016年1—5月在河南省农业科学院现代农业研究开发基地(原阳)进行。

1.1　材料

红叶樱花为5年生树苗，种植在原阳基地。选取3株生长健壮一致的植株并标记，每月中旬从这3株植株上剪取直径≤0.2 cm的枝条作为外植体，进行不同采集时期外植体萌芽研究。

1.2　方法

1.2.1外植体采集时期对红叶樱花腋芽萌芽的影响分别于1月19日、2月17日、3月15日、4月20日和5月18日剪取红叶樱花枝条，拿至实验室进行消毒预处理，先用流水冲洗30 min，然后用软毛刷在肥皂水里轻轻洗枝条，最后流水冲洗30 min。将初步消毒后的枝条送至超净工作台，剪成长1.5～2 cm、带1～2个腋芽的茎段，放进无菌空瓶里，用75%乙醇灭菌30 s，再用0.1%HgCl2灭菌10 min，最后用无菌水冲洗4～5遍。

1—3月的红叶樱花枝条为1年生枝条，木质化程度高，腋芽外边包裹着鳞片，外植体灭菌后，存在污染率高的问题，因此，对这个时期的外植体采用灭菌后剥去芽外部鳞片的方法接种。4—5月的红叶樱花枝条为当年萌发新枝条，枝条光滑幼嫩未木质化，采用带腋芽茎段进行接种。接种后30 d统计外植体的萌芽率和污染死亡率。污染死亡率=污染死亡个数/接入数×100%；萌芽率=萌芽数/(接入数-污染死亡数)×100%。

1.2.2不同采集时期红叶樱花外植体内源物质含量的测定在采集红叶樱花外植体进行萌发试验的同时，随机取带芽枝条进行外植体的可溶性糖、可溶性蛋白和内源激素含量测定。将腋芽从枝条上切下后，混合然后称质量，每份0.5 g，各指标均重复3次，迅速用液氮速冻，然后-80 ℃超低温冰箱保存。可溶性糖含量采用蒽酮法测定，可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝G-250染色法测定，具体方法步骤参考《植物生理学实验指导》[13]，内源激素含量的测定采用高效液相色谱方法，由苏州科铭生物技术有限公司代测。

试验数据采用DPS V6.55软件进行差异显著性(P<0.05)分析，用Excel软件作图。

1.3　启动培养基及培养条件

外植体启动培养基为MS，附加6-BA 1.0 mg/L、NAA 0.01 mg/L、蔗糖30 g/L、琼脂6g/L，pH值 5.8。培养条件为(25±2)℃，光照强度2 500 lx，光照时间12 h/d。

2　结果与分析

2.1　不同采集时期对红叶樱花腋芽萌芽的影响

不同采集时期，枝条上腋芽的形状、生理状态不同，1月中旬到3月中旬采集的为1年生枝条上的腋芽，个体大，饱满，长椭圆形，外边包裹着多层鳞片；4月中旬和5月中旬，为当年新萌幼嫩枝条上的腋芽，个体小，三角形，外边光滑。分别以这2种枝条上的腋芽为外植体，其灭菌后的污染死亡率、萌芽率都不相同(表1)。从萌芽率来看，5个采集时期的萌芽率差异显著，其中以4月萌芽率最高，为100.0%，显著高于其他4个采集时期的萌芽率，其次是5月和3月萌芽率分别为78.3%和76.0%，二者差异不显著，从污染死亡率来看，以1月和5月采集的外植体污染死亡率最低，分别为6.5%和4.6%，显著低于其他3个采集时期，1月份的气温低，微生物较少，随着气温回升，杂菌逐渐增多，因此污染率较高；4月份由于采集刚萌发的枝条，鳞芽幼嫩，灭菌后外植体容易出现变褐死亡现象，污染死亡率也高。综合而言，采集当年新萌发枝条上的腋芽，其萌芽率均高于1年生枝条上腋芽的萌芽率，说明4—5月为红叶樱花外植体适宜的采集时期，4月中旬采集外植体，可以获得最高的萌芽率。

表1　不同采集时期对红叶樱花外植体萌芽的影响

注：同列数据后不同字母表示差异显著(P<0.05)。

2.2　不同采集时期对红叶樱花外植体可溶性糖含量的影响

红叶樱花外植体中可溶性糖含量变化见图1，1月中旬至5月中旬，红叶樱花外植体的可溶性糖含量呈现先下降后上升趋势。1月中旬外植体仍处于休眠期，其体内可溶性糖含量最高，这与植物的抗性相关，低温下，鳞芽内可溶性糖含量增加可以增加细胞的渗透压，从而降低冰点，提高抗寒性；1月中旬到2月中旬，可溶性糖含量略微减少，处于休眠期的鳞芽各项生命代谢活动缓慢，对能量的需求较少；2月中旬之后，鳞芽内可溶性糖含量迅速下降，此时气温回升，日照延长，鳞芽休眠解除，代谢活动逐渐增强，对糖类消耗增加；4月中旬，新萌发枝条处于旺盛生长期，对碳水化合物的需求大，此时可溶性糖含量最低；此后随着植株的生长，合成的有机物质多于消耗，外植体内的可溶性糖含量增加。

图1　不同采集时期红叶樱花外植体可溶性糖含量变化

2.3　不同采集时期对红叶樱花外植体可溶性蛋白含量的影响

外植体的采集时期不同，其可溶性蛋白含量也不相同，从图2可以看出，1月中旬到5月中旬，红叶樱花外植体的可溶性蛋白含量呈现先下降后上升的趋势。在1月份可溶性蛋白含量较高，可溶性蛋白可以增加细胞的持水力，增加植株的抗寒性；此后随着气温开始回升，树液开始流动，鳞芽休眠逐渐打破，可溶性蛋白含量开始降低；2月中旬到3月中旬，可溶性蛋白含量保持稳定；3月中旬之后鳞芽萌发，抽出新枝，生命活动更加活跃，各种酶活性增强，鳞芽体内的可溶性蛋白含量上升。此外，植物体内可溶性蛋白和可溶性糖含量变化是植物解除休眠开始萌发的重要信号，在3月中旬气温回暖，腋芽萌动的情况下，可溶性蛋白含量率先开始升高，而可溶性糖含量在4月中旬开始升高，说明腋芽主要完成了蛋白质、酶、脂类等物质的积累，为萌发相关代谢基因诱导、生理生化反应提供重要的物质基础。

图2　不同采集时期红叶樱花外植体可溶性蛋白含量变化

2.4　不同采集时期对红叶樱花外植体内源激素含量的影响

随着红叶樱花外植体采集时期的不同，植物内源激素ZA、IAA、GA3和ABA含量也有明显的变化(图3)。ZA含量总体呈现上升趋势，其中在1—4月外植体ZA含量差异不显著，5月外植体中ZA含量显著高于其他4个处理。1月中旬到3月中旬，外植体中ZA含量基本上在39.07 ng/g左右；到4月中旬，ZA含量降至28.98 ng/g后；之后开始急剧上升至137.18 ng/g。3月中旬到4月中旬外植体中ZA含量略微下降，此时休眠鳞芽开始萌发，细胞分裂素的作用是解除芽的休眠并促进细胞分裂，因此含量有所下降，4月之后新梢形成，根尖和嫩梢是其合成的主要部位，外植体中的ZA含量也大幅上升。

图3　不同采集时期红叶樱花外植体内源激素含量变化

IAA含量在整个采集时期呈现下降趋势，1—3月外植体中IAA含量差异不显著，但均显著高于4月和5月外植体IAA含量。1月采集的外植体IAA含量最高，这可能是植物内源激素IAA对低温的应激响应，低温影响IAA极性运输，同时抑制了IAA氧化酶活性；随着温度回升，树液流动，IAA在植株内极性向下运输，鳞芽中IAA含量逐渐下降，3月中旬到 4月中旬鳞芽萌发形成幼嫩新梢，外植体中IAA含量急剧下降，4月中旬到5月中旬，新梢生长旺盛，IAA合成较多，外植体内的IAA含量下降趋势变缓。

GA3含量在1月中旬到5月中旬呈上升趋势，在1月中旬和2月中旬的外植体中未检测出来，从3月中旬的外植体中检测到少量的GA3，4月到5月新萌枝条生长加快，外植体中的GA3含量大幅增加，其中3月和4月外植体中GA3含量差异不显著，但均显著低于5月的GA3含量。

ABA含量在整个采集时期中变化幅度较小，介于2.37～2.51 ng/g，呈现先缓慢上升然后缓慢下降的趋势，各处理间差异不显著。从1月中旬到2月中旬，ABA含量略微上升，2月中旬之后，ABA含量开始下降。ABA往往是IAA、CA3和ZA的拮抗物，它的消长过程大体上和生长进程是相反的。

2.5　不同采集时期红叶樱花外植体内源激素含量比值的变化

从图4可以看出，1月中旬到5月中旬，GA3/ABA、ZA/ZAA比值均呈上升趋势。在1月中旬到2月中旬采集的外植体中，GA3/ABA、ZA/IAA比值均很低，GA3/ABA比值在2月中旬之后开始缓慢上升，ZA/IAA从3月中旬之后缓慢上升，两组比值在4月中旬开始大幅上升，说明1月中旬和2月中旬采集的外植体，仍处于休眠状态；3月中旬采集的鳞芽已经开始萌动，GA3/ABA比值虽然已经开始上升，但是ZA/IAA比值仍旧很低；4月中旬之后采集的外植体，GA3/ABA和ZA/IAA均明显提高，此时外植体接种后萌芽率也最高。

图4　不同采集时期红叶樱花外植体内源激素含量比值变化

3　结论与讨论

在植物组织培养中，外植体的萌发受年龄、生理状态、采集时期等多种因素影响，一般具有生长点且处于萌动状态的幼嫩外植体容易诱导萌芽，处于旺盛生命活动的外植体萌芽率高，多数木本植物选择春季采集新萌发枝条作为外植体[14]，也有一些木本植物会避开酚类物质含量多的时期，避免褐化伤害[15]。1月中旬到3月中旬采集的红叶樱花外植体，萌芽率较低，并且外植体萌发后处于生长停滞状态，主要表现为叶片展开小，茎短缩；4—5月采集外植体，萌芽率高，能够正常展叶抽茎，但5月酚类物质含量增加，褐化伤害加重，而4月中旬外植体萌芽率最高，是最适的采集时期，这与郭文久[16]、胡雪雁等[17]的研究结论一致。

植物内源激素是调节芽休眠与萌发的重要因子，Horvath等[18]认为休眠是由内源激素中促进生长物质和抑制物质之间的平衡状态决定的，ABA和GA3在促进植物适应低温胁迫中发挥重要作用，IAA代谢也是植物抗寒力调控系统的一部分[19]。低温胁迫能够降低植物体内IAA氧化酶含量，一般情况下，IAA氧化酶活性越高，IAA含量越少，生长受抑制的程度越高，低温同时也抑制IAA的向下运输[19-20]。1—2月中旬红叶樱花枝条腋芽的IAA含量降低，2—3月中旬IAA含量升高，表明2月中旬红叶樱花开始慢慢解除低温胁迫，与ABA变化时期相一致、变化方向相反。ABA是重要的休眠因子，GA3是重要的解除休眠因子[11]。在寒冷来袭，木本植物进入休眠时ABA不断积累直至解除休眠前达到最高，GA3在进入休眠时含量逐渐降低，在解除休眠前达到最低。红叶樱花不同时期的腋芽中内源激素ABA和GA3含量呈现不同的变化，其中ABA含量在1—2月中旬缓慢上升后缓慢下降，GA3含量在3月中旬开始提高。表明红叶樱花解除休眠从2月中旬开始，ABA含量的降低优先于GA3含量的升高，GA3/ABA比值在3月中旬大幅提高，腋芽萌动出幼嫩绿芽，进一步表明了ABA、GA3以及GA3/ABA比值在指示红叶樱花腋芽萌发中的重要作用。ZA能够促进细胞分裂和扩大，诱导芽分化，在红叶樱花的5个采集时期中，前3个时期变化不大，从4月中旬开始增加，整体来看，ZA对外植体萌芽起促进作用，这与牡丹打破休眠中的变化规律一致[11]。

此外，本研究表明，GA3/ABA比值和ZA/IAA比值不仅反应出腋芽休眠、萌发的状态，也对红叶樱花组培生产具有重要指导作用。在红叶樱花的不同采集时期中，GA3/ABA比值在1月中旬和2月中旬很低，说明此时的外植体仍处于休眠状态；在3月中旬，GA3/ABA比值开始上升，外植体休眠解除，开始萌动，3月中旬采集的外植体，其萌芽率比1月中旬和2月中旬高，但是外植体萌发后生长缓慢，能够展叶但是茎短缩，影响后期的增殖培养；在4月中旬，ZA/IAA比值开始上升，植株处于旺盛生长时期，新梢形成并伸长生长，此时取外植体萌芽率最高。

综合上述，可溶性糖、可溶性蛋白、内源激素(IAA、ABA、GA3和ZA)在红叶樱花低温胁迫和休眠、萌发的过程中都具有重要作用，同时具有着一定的规律，1—2月中旬红叶樱花处于休眠期；2—3月中旬ABA、IAA和可溶性蛋白含量开始反向变化，慢慢解除休眠，3月中旬解除休眠因子GA3和可溶性糖含量大幅增加，GA3/ABA比值大幅上升；4月ZA/IAA比值开始上升，是影响红叶樱花外植体萌发的重要因素，表明GA3和GA3/ABA比值在指示红叶樱花休眠中具有重要作用，ZA和ZA/IAA比值在红叶樱花腋芽组培生产中具有重要指导作用。春季新萌枝条适宜作为红叶樱花组织培养的外植体，排除酚类物质引起的褐化影响，最适的采集时期是4月中旬。