β-内啡肽基因在小鼠体内表达的生物效应研究

李星 ，白光明 *，万小平 *，程驰 ，李江淩 ，吕学斌 ，王泽洲 ，高荣 **

（1.四川大学生命科学学院，生物资源与生态环境教育部重点实验室，四川省动物疫病预防与食品安全重点实验室，四川 成都 610064；2.四川理工学院生物工程系，四川 自贡 643000；3.四川省畜牧科学研究院，四川 成都 610066；4.四川省动物疫病预防控制中心，四川 成都 610041）

β-内啡肽（β-endorphin，EP）由 31个氨基酸组成，可由动物下丘脑-垂体自身合成[1]。通常情况下仅少量释放到血液中，在应激情况下释放入血增多，发挥重要的抗应激和抑制疼痛的效应[2]。近来发现，免疫系统也能够产生β-内啡肽，主要是外周血单个核细胞（PBMC）合成的，PBMC主要包括单核细胞和淋巴细胞，其中T型记忆细胞中β-内啡肽含量比较高。在炎症或者应激情况下，PBMC中的β-内啡肽含量会显著升高，然而血浆中的β-内啡肽含量并未发生变化。有研究表明淋巴结中的β-内啡肽含量要显著高于血浆，说明β-内啡肽在免疫细胞中合成后被送到淋巴结中[3]。β-内啡肽是由促阿黑皮素原的前体POMC加工形成的，曾在免疫细胞中发现有全长表达的mRNA，只是mRNA要比垂体中的mRNA短约200 bp，并且没有信号肽序列。说明β-内啡肽在PBMC中的分泌形式同细胞因子十分相同，不需要信号肽前体就能分泌释放[4]。小鼠的下丘脑中很多β-内啡肽都具有生物学活性[5]。

对于β-内啡肽在免疫方面的作用有很多报道，效应不一，主要表现为抑制作用。动物生产和运输中，动物的应激不仅导致其生长和生产性能下降，而且持续的应激可造成免疫抑制，降低抗病能力，容易感染病原发病；同时减弱动物对疫苗的免疫应答，致使其免疫保护力降低、保护期缩短。除传统的饲养管理措施和化学药物外，目前迫切需要新技术来控制或减少动物应激发生，因此，本研究进一步探索了β-内啡肽的生物学效应。我们利用壳聚糖及其修饰分子包裹β-内啡肽重组基因质粒，制备纳米颗粒剂肌肉注射实验小鼠，同时用重组毕赤酵母菌进行灌胃口服，比较探索β-内啡肽基因在小鼠体内表达的抗应激和免疫生物活性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 真核载体质粒、毕赤酵母和实验动物 β-内啡肽基因（EP）的重组VR1020表达质粒-VREP：由四川大学生命科学学院实验室构建；VR1020：真核表达质粒，美国Vical公司提供，由本单位实验室保存；β-内啡肽基因的重组酵母表达载体pGAPZαA-EP：由四川大学生命科学学院实验室构建；3周龄18～20 g健康雌性昆明小白鼠：由四川省人民医院实验动物中心提供。

1.1.2 试剂 Fluorescein isothiocyanate（FITC）antimouse CD4 和 Phycoerythrin（PE） anti-mouse CD8a（Lγ-2）：均购于 eBioscience公司；多聚磷酸钠：购自天津市海晶精细化工厂；IgG、IgG1、IgG2a ELISA试剂盒：购自R&D公司；EDTA-K2：购自科龙试剂公司。1.1.3 包裹用纳米材料 壳聚糖（CS，MW：15KD，脱乙酰度95%）：购自Sigma-Alorich公司；mPEG-PEICS（聚乙二醇和乙烯亚胺修饰的壳聚糖分子）：由四川大学化学学院李瑛老师于实验室合成。

1.2 方法

1.2.1 质粒DNA的大量制备 真核重组大提质粒大提具体步骤（参照Omega无内毒素质粒大提试剂盒）：内毒素检测依据鲎试剂凝胶法说明书进行。重组质粒和VR1020质粒的内毒素含量均低于标准值（0.1E/mg）。

1.2.2 纳米颗粒的制备 用离子交联法制备质粒DNA壳聚糖纳米颗粒[6]。

1.2.3 毕赤酵母菌体准备 接种已构建正确的含有重组质粒pGAPZαA和 pGAPZαA-EP的毕赤酵母至YPD培养基中，30℃、220 r/min培养36 h，室温下4000r/min离心5min，用新鲜培养基重悬菌体，调节菌液浓度至每0.3mL菌液含108个酵母细胞。

1.2.4 实验动物分组 将50只18～20g的3周龄雌性昆明小白鼠随机分成5组，每组10只。分组及处理见表1。

表1 实验小鼠分组及处理

1.2.5 小鼠外周血免疫细胞数量测定 注射纳米颗粒及灌胃之前首次采血，注射及灌胃后每周固定时间采尾静脉血一次，用血球自动计数仪进行血常规检测。

1.2.6 EP对小鼠生长的影响 50只小鼠分组后，试验前分别称取每组小鼠的体重，以后每周固定时间称取小鼠体重，观察小鼠生长变化。

1.2.7 CD4+、CD8+T细胞的检测 免疫后14d、28d采集实验小鼠尾静脉抗凝血，用以检测CD4+、CD8+T细胞亚群的变化。每组分别加入FITC和PE分子标记的大鼠抗小鼠CD4+、CD8+T单克隆抗体。用Coulter流式细胞仪分析小鼠血液CD4+、CD8+T细胞群的变化。

1.2.8 免疫小鼠血清IgG、IgG1、IgG2a含量的测定 小鼠免疫前及免疫后每周自尾静脉采血，采用双抗体夹心法ELISA试剂盒测定小鼠外周血血清中的IgG、IgG1、IgG2a、β-内啡肽以及皮质醇的含量。

1.2.9 免疫相关基因的定量PCR检测 免疫相关基因的定量PCR表达分析用Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪进行。以免疫小鼠血细胞cDNA为模板，根据表2中的定量引物进行扩增。

表2 免疫相关基因的扩增引物

所得的试验数据均用方差分析进行差异显著性比较，以P＜0.05为差异显著性标准。

2 结果

2.1 纳米颗粒的形态、粒径及Zeta电位 4种纳米颗粒在SEM观察并拍照，纳米颗粒大小与预期相同。SEM图片见图1、图2。

利用Zeta sizer分析仪检测纳米颗粒的粒径及Zeta电位，得出纳米颗粒平均粒径大小均在100～230nm之间，其中所有的纳米颗粒都带正电荷，合乎转染细胞表达基因的要求。

2.2 凝胶阻滞分析 用材料CS、mPEG-PEI-CS包裹质粒VREP，形成的纳米颗粒利用0.7%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示：包裹好的纳米颗粒完全阻滞在点样孔，没有溢出。说明质粒已被壳聚糖分子充分包裹形成了纳米颗粒。

2.3 小鼠体重变化情况 试验前、后每周采血前定时称量小鼠体重，观察生长变化情况。由图3可知：第7d～21d，注射 VREP-CS、VREP-PEG-PEI-CS 的小鼠的生长速度显著高于对照组（P＜0.05），28d后这两组小鼠的生长速度逐渐减缓，35 d时这两组小鼠的体重与对照组差异不显著（P＞0.05）。说明注射组小鼠在试验前期的进食量可能要高于对照组，这与β-内啡肽能够在短期内增加食欲的作用是一致的。而酵母口服试验组和对照组小鼠的体重差异不显著（P＞0.05）。

图1 VREP-CS约 100～200nm

图2 VREP-mPEG-PEI-CS约 50～100nm

图3 实验小鼠免疫后体重的变化情况

2.4 CD4+、CD8+T细胞亚群的数量变化 用流式细胞仪分析小鼠血液中CD4+、CD8+T淋巴细胞的比例变化。由图4可知：免疫后14d和28d，注射VREPCS、VREP-PEG-PEI-CS纳米颗粒的试验组及酵母口服组的CD4+、CD8+T淋巴细胞比例与对照组相比均有显著增加（P＜0.05）；但此期注射VR1020裸质粒和口服酵母空载体，这两组小鼠的CD4+、CD8+T淋巴细胞所占比例差异不显著（P＞0.05）。

图4 小鼠CD4+、CD8+T细胞含量变化

2.5 IgG、IgG1、IgG2a含量测定 由图5可知：从第7 d到28d，注射组免疫小鼠的血清IgG含量均较对照组小鼠有明显升高（P＜0.05）；从第7 d开始，口服组小鼠的血清IgG含量与对照组相比均有明显升高（P＜0.05），说明试验组小鼠的体液免疫水平较对照组显著提高。从第7d到35d，所有小鼠的血清IgG1、IgG2a含量与对照组相比均无明显上升（P＞0.05）。

2.6 免疫小鼠血清β-内啡肽含量测定 β-内啡肽是免疫系统应答和应激的介质[7]。由图6可知：实验小鼠从第7d到21d，血清中的β-内啡肽含量逐渐增加，与对照组差异显著（P＜0.05）；第 21d后，试验组与对照组的差异逐渐缩小。说明体内β-内啡肽含量从第0d开始逐渐增加，第21d时达到最高峰，之后又逐渐减少，可能是接种质粒的表达效应减弱所致。

2.7 免疫小鼠血清皮质醇含量测定 机体内很多激素类物质通常能够客观地反映应激对机体的影响程度，应激情况下机体的生理反应通常表现在体内皮质醇含量增加[8]。由图7可知：第14d时，注射VREPCS、VREP-PEG-PEI-CS的免疫小鼠，其血清中的皮质醇含量最高，其余时期皮质醇含量与对照组相比差异不显著（P＞0.05）。

图5 实验小鼠血清IgG、IgG1、IgG2a含量变化

2.8 免疫相关基因表达水平的变化 试验测得：接种后 7d 开始，TLR1、TLR4、TLR6、TLR9、TGF-β、IL-1、IL-23这7种基因的表达水平相比对照组均有显著提高（P＜0.05）（重组质粒组7d和mPEG-PEI-CS组的IL-1例外），说明接种重组质粒及重组酵母菌均能激发这几种基因的表达。除TLR6外，其他6种基因的表达量均在免疫后21d达到最高峰；而TLR6基因在免疫后7d达到最高表达量，之后逐渐降低。

图6 实验小鼠血清β-内啡肽含量变化

图7 实验小鼠血清皮质醇含量变化

4 结论与分析

相关研究表明，β-内啡肽对免疫系统有抑制作用。阿片肽受体拮抗物——纳洛酮和纳曲酮能够增强NK细胞的活性，丝裂原能诱导外周血单核细胞以及脾细胞在几分钟之内出现增殖反应[9]。阿片肽受体拮抗物还能使实验性过敏性脑脊髓炎的病情恶化，然而外界应激刺激在增加外周血单核细胞中β-内啡肽含量的同时，却能够抑制该病情的进一步恶化[10]。

本试验利用壳聚糖改性分子包装质粒VREP，肌肉注射小鼠，并利用重组酵母菌灌胃小鼠，结果发现注射组和口服组小鼠均能在短期内增加食欲，进而增加体重；对小鼠外周血中的白细胞、血小板、红细胞及血红蛋白的含量影响不显著（P＞0.05）；试验组小鼠血清中的IgG含量显著升高，IgG1和IgG2a含量与对照组差异不显著（P＞0.05）；接种小鼠从第7d到21d，血清中的β-内啡肽含量较对照小鼠明显增加，体内β-内啡肽含量的升高，反映其抗应激能力增强，且这些小鼠均未观察到任何局部病变或炎症损伤。由此说明试验组的体液免疫水平明显上升，抗应激能力提高；且重组质粒注射或重组酵母口服均对动物无不良影响。

Toll样受体（TLR）、IL-23、TGF-β 在启动抗微生物病原体免疫反应，促进炎症组织修复、细胞生长分化以及免疫调节等方面起着关键作用。免疫后7d开始，重组质粒纳米颗粒及重组酵母菌会激发7种免疫相关基因的表达，使其表达水平相对于接种前均显著提高（P＜0.05），提示接种后产生了较好的先天性免疫和获得性免疫增强效应。

总之，本试验表明β-内啡肽基因重组质粒纳米颗粒和重组酵母菌可提高实验小鼠的细胞免疫和体液免疫水平，增强机体抗应激能力。这为进一步探索β-内啡肽在动物抗应激及其免疫调节中的作用奠定了基础，也为研发安全高效的抗应激生物制剂提供了新的科学依据，在商业化应用方面具有潜在价值。

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