大麦青稞小孢子高频再生体系的建立及其在遗传育种上的应用

刘成洪，郭桂梅，何 婷，陆瑞菊*，黄剑华*

（1.上海市农业科学院生物技术研究所，上海201106；2.上海市农业遗传育种重点实验室，上海201106）

大麦是我国啤酒工业不可替代的主体原料，也是畜牧养殖业的优质能量饲料，还是营养价值丰富的食品加工原料，对促进国民经济发展和满足人民群众健康生活需求发挥重要作用。青稞为食用裸大麦，是青藏高原藏族人民等赖以生存和繁衍的主要食物来源，对西部发展和边疆稳定也具有重要意义[1]。我国大麦种植区域辽阔，生产用途多样化，市场需求巨大，因此需要选育更多更好的大麦新品种来满足国内生产需要[2]。

要加速新品种的选育，必须加大育种技术研发力度。小孢子培养技术是近年来发展起来的一项高效的单倍体育种手段，该技术已在油菜、烟草和大麦等作物育种中实现[3]，但这一技术的真正推广应用在很大程度上受到技术体系的成熟度和育种材料的基因型限制。为了解决大麦青稞育种中的这一瓶颈问题，笔者所在植物细胞工程科研团队经过多年技术攻关，在大麦中建立了小孢子高频再生的成熟体系，并在来自全国各地大量育种材料中成功取得小孢子培养再生绿苗，进一步与各地育种团队合作育成了一批大麦和青稞优良新品系和品种，在此基础上还拓展了系列大麦遗传改良新方法。

1 大麦小孢子高频再生体系的建立

针对大麦生产上的主栽品种或育种材料建立小孢子高频再生体系，是将小孢子培养技术应用于大麦育种生产实践的一个前提条件。只有通过小孢子离体培养再生，获得足够多的加倍单倍体（double haploid，DH）植株，进一步产生永久纯合稳定的DH株系，才能用于目标性状筛选。笔者通过对供体植株生长、离体穗预处理、小孢子游离提取液、小花共培养、诱导培养基、转分化时间、分化培养基、壮苗生根、倍性鉴定、加倍处理、炼苗移栽等各个步骤进行优化，针对我国大麦主栽品种或育种材料建立了小孢子高频再生体系（表1）。

利用上述建立的大麦小孢子高频再生体系，从我国大麦栽培的不同生态区，选取代表性主栽品种，于2017年开展了游离小孢子培养。针对北方春大麦区，选取了黑龙江省农垦总局红兴隆农业科学研究所选育的垦啤麦7号和甘肃省农科院啤酒原料研究所选育的甘啤6号；针对黄、淮以南秋播大麦区，选取了江苏沿海地区农业科学研究所与中科院遗传所合作选育的苏啤3号，同时选取了上海市农业科学院与浙江省嘉兴市农业科学研究院合作选育的花30作为对照。结果表明，在4份大麦主栽品种中，花30的小孢子再生绿苗频率最高（表2），达到平均每皿378.7株（小孢子为1×105个/皿），较前期报道的另一大麦主栽品种花22的小孢子绿苗再生频率[253株/（1×105个小孢子）]有了更进一步提高[4]，超过了国外花培反应高的模式品种Igri的再生频率，其最高花培再生频率为1 009.8株/（100个花药），绿苗数占总再生苗的87.6%[5]，按每个花药平均获得3 000个游离小孢子折算[6]，其再生频率为295株/（1×105个小孢子）。其次为甘啤6号，小孢子绿苗再生频率为216.3株/（1×105个小孢子），有着较高的绿苗比例（表2）。由此可以看出，4份材料的小孢子再生绿苗单皿均可达到百株以上。此外仍有部分白苗，白苗比例过高是将来小孢子高频再生体系中需要进一步解决的问题。

表1 大麦小孢子高频再生体系的优化

表2 我国大麦栽培不同生态区4份代表品种的游离小孢子培养结果

针对青藏高原裸大麦区的青稞作物，也是小孢子培养中迟钝基因型材料，陆瑞菊等已在国际上首次报道了青稞的小孢子再生成苗技术[7]，目前正在开展高频再生体系优化工作。

2 小孢子高频再生技术在大麦青稞育种中的应用

自2009年起，笔者利用建立的小孢子高频再生技术，结合在此基础上发展形成的小孢子高盐、低氮、赤霉病菌毒素胁迫培养筛选等新方法，连续为湖北、甘肃、黑龙江、内蒙、青海等地的大麦青稞育种团队提供育种材料的小孢子培养公益服务，截止2017年底已培养育种材料528份，获得再生植株12万多株（表3）。近5年来每年都有上万份小孢子再生苗移栽云南昆明基地，成活率达90%以上，再生植株结实率达90%以上。各育种团队获得小孢子培养形成的加倍单倍体株系后，在当地开展鉴定性试验和品比试验，快速形成了一批优良大麦青稞新品系和品种（表4、表5），极大地提高了我国大麦青稞主产区的育种效率。

在建立大麦小孢子高频再生技术的基础上，近年来还发展了3项遗传改良的新方法，目前已取得初步应用效果：1）不经种子的单株小孢子高效培养技术（专利申请号：201510890842.3）。利用小孢子培养高频再生基因型大麦花30品种，不仅实现了当代单株来源小孢子高频再生[8]，而且实现了不经种子阶段的再生植株小孢子高频再生，这一技术目前已用于大麦花30与西藏野生大麦远缘杂交胚挽救形成的F1小孢子培养，为野生种质材料外源基因渗入栽培种的难题提供了新的解决途径。2）基于小孢子高频再生体系的转基因方法（专利申请号：201611011357.5）。利用农杆菌直接侵染游离培养小孢子，成功将目标基因BAK03316转入大麦品种“花30”中，转化效率约为17%，远远高于前期用基因枪轰击花药转化小孢子的频率[16]；利用CRISPR/Cas9基因编辑系统对MLO基因 (白粉病广谱抗性基因)在小孢子水平进行编辑，获得的大麦花30（高感白粉病）小孢子再生植株对接种白粉病表现出高抗，目前正在进行基因编辑效率研究。3)单倍体群体构建方法（专利申请号：201410710796.X）。利用小孢子培养中获得的单倍体植株，采用基部分蘖节诱导丛生芽的方法成功获得大量单倍体再生植株[14]，继代5次后鉴定仍然保持单倍体倍性，建立了单倍体无性繁殖的稳定群体[15]，解决了单倍体种质保存与常年利用的难题，目前已从保存单倍体植株中制备获得了叶肉细胞原生质体，并正在开展转基因和基因编辑研究。

3 展望

小孢子培养技术提供了一个单倍体生殖细胞离体培养再生系统，相比传统花药培养更高效。有研究报道大麦中小孢子培养再生绿苗相比花药培养平均提高9.3倍[17]，表明小孢子培养技术在绿苗高频再生方面比花药培养技术更有潜力。尽管国内外已有大麦小孢子培养方法优化的系列报道，但要将小孢子培养技术真正用于育种，首先要针对生产上大量使用的育种材料优化小孢子培养方法，突破基因型障碍；其次要建立一套高频再生绿苗程序，获得大量小孢子再生植株；最后，还需要建立一套高效的加倍单倍体形成方法。笔者所在团队已通过技术研发建立了上述一整套小孢子高频再生技术体系，并用于大麦青稞的规模化育种，实现了在1～2年内从1个优良杂交组合获得上百份永久纯合的加倍单倍体，可供育种家开展多年、多目标性状的筛选鉴定，大大加速了育种进程，提高了常规育种效率，显示出了巨大的应用潜力。

突破大麦小孢子高频再生技术瓶颈，经单个培

养皿培养就可以获得上百株再生植株，在此基础上还可发展单倍体细胞水平的诱变、胁迫筛选、转基因、基因编辑以及原生质体融合等多种技术手段[18]。笔者所在团队早期利用小孢子培养中加入高盐、低氮、赤霉病菌毒素等非生物胁迫处理，结合诱变或杂交手段获得的加倍单倍体株系中成功筛选到了一批耐盐性、耐低氮性和抗病性提高的突变体材料[19-22]，初步显示了诱变、杂交等传统育种手段与小孢子胁迫培养结合形成的细胞工程复合育种技术的应用潜力。近年来，基于小孢子高效培养体系拓展的不经种子阶段的单株小孢子连续培养、单倍体群体构建与单倍体材料的转基因、基因编辑以及原生质体培养等技术也取得了一定进展，且正在进一步优化中。这些技术的研发将在麦类作物遗传改良的基础研究和应用研究方面发挥重要作用，同时也为水稻、小麦等重要禾谷类作物的遗传改良提供有益借鉴。

表3 不同来源大麦青稞材料的小孢子培养再生绿苗频率

表4 利用小孢子育种技术选育的大麦青稞新品系

表5 利用小孢子育种技术选育的大麦青稞新品种

参考文献：

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