乙醛脱氢酶基因表达载体的构建及表达条件筛选

张传丽， 高明侠， 董玉玮， 王 陶， 李同祥， 高兆建

(1.徐州工程学院江苏省食品资源开发与质量安全重点建设实验室，江苏徐州 221008；2.徐州工程学院江苏省食品安全生物芯片检测技术工程实验室，江苏徐州 221008)

3-羟基丙酸(3-hydroxypropionic acid，3-HP)是一种具有3个碳原子的非手性液态有机酸，是一种重要的化学中间体，是很多光学活性物质的合成前体，具有重大的开发价值[1-2]。传统的化学合成法生产3-HP常具有能耗高、污染大、副产物多、分离困难等缺点，而生物方法生产3-HP则可以有效地避免这些不利因素，因此采用生物方法制备3-HP成为现在国际上最注目的研究热点之一[3]。

乙醛脱氢酶(acetaldehyde dehydrogenase，ALDH)是一种广泛存在于原核生物和真核生物中的氧化还原酶，可将多种脂肪族醛和芳香族醛氧化生成相应的脂肪族酸和芳香族酸[4-5]。ALDH是微生物发酵生产3-HP过程中的关键酶之一，具有重要的研究意义。

本研究以酿酒酵母中的ALDH为对象，将从酿酒酵母中克隆到的ALDH基因连接到pET30a(+)表达载体中，构建ALDH基因的原核表达载体，得到含有pET30a-ALDH重组质粒的转基因菌株，并分析不同培养条件下ALDH催化反应的活性差异。

1 材料与方法

1.1 菌株和质粒

大肠杆菌E.coliDH5α和BL21(DE3)感受态细胞购买自上海迈其生物科技有限公司；酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae) W303-1A来源于山东大学鲍晓明教授实验室；pMD18-T克隆载体购买自宝生物工程(大连)有限公司；pET30a(+)表达载体来源于江苏沿海地区农业科学研究所。

1.2 酶和试剂

BamHⅠ、SacⅠ、T4DNA连接酶、TaqDNA聚合酶、高保真DNA聚合酶、DL2000 DNA Marker等购买自宝生物工程(大连)有限公司；琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒购买自北京艾德莱生物科技有限公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.3 培养基

YPD培养基：酵母膏1%(质量浓度)，蛋白胨2%(质量浓度)，葡萄糖2%(质量浓度)；LB培养基：酵母膏0.5%(质量浓度)，蛋白胨1%(质量浓度)，NaCl 1%(质量浓度)。

1.4 重组质粒pET30a-ALDH构建

以酿酒酵母基因组DNA为模板、以Primer-F和Primer-R为引物进行酿酒酵母ALDH基因克隆。其PCR反应体系见表1。

表1酿酒酵母ALDH基因PCR反应体系

PCR反应程序为98 ℃ 3 min；98 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃ 10 min。

PCR反应产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测后回收，与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，菌落PCR筛选转化成功的pMD18-T-ALDH重组质粒。其菌落PCR反应体系见表2。

表2pMD18-T-ALDH重组质粒菌落PCR反应体系

PCR反应程序为94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，28个循环；72 ℃ 1 s。

pMD18-T-ALDH重组质粒回收后，进行BamHⅠ 和SacⅠ双酶切；酶切产物回收、纯化之后连接到同样双酶切、纯化后的pET30a(+)载体上，连接产物转化宿主菌DH5α和BL21(DE3)，经PCR检测、酶切和测序验证ORF正确的克隆用于ALDH蛋白表达。

1.5 乙醛脱氢酶活力测定

ALDH酶催化反应液成分见表3。

表3ALDH酶催化反应液成分

将0.5 mL酶液与1 mL上述反应液混合，反应体系在 25 ℃ 下保温5 min，在340 nm波长下测其吸光度[8-11]。

酶活单位定义：标准反应条件下，1 min催化生成1 mmol NADH所需要的酶量被定义为1个活力单位(U)。

1.6 ALDH在Escherichia coli BL21(DE3)中的表达

将含重组质粒的大肠杆菌菌株接种单菌落于LB液体培养基(含卡那霉素30 μg/L)中，37 ℃、180 r/min培养10～12 h 至菌液D600 nm值达到0.6～0.9后，分别加入终浓度为 0.3、0.5、0.8、1.0 mmol/L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，于150 r/min条件下进行ALDH酶蛋白诱导培养。诱导培养的温度分别为28 ℃和 37 ℃，培养时间分别为0、2、4、6、8 h。离心收集菌体，称量菌体湿质量。

1.7 大肠杆菌细胞的破碎

取0.5 g湿菌体，悬浮于含2 mmol/L的二硫苏糖醇的 10 mL 磷酸缓冲液中，冰上超声波破碎菌体(功率400 W，工作2 s，间隔3 s，40次)，8 000 r/min、4 ℃离心10 min，收集上清液，即为ALDH粗酶液[9]。

2 结果与分析

2.1 重组表达质粒的构建

以酿酒酵母W303-1A基因组DNA为模板、以Primer-F和Primer-R为引物，进行酿酒酵母ALDH基因的PCR克隆，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，发现本试验中克隆得到的条带大小与预期的基因片段大小一致，约1.6 kb，如图1所示。

将上述PCR产物经琼脂糖凝胶回收后，连接到pMD18-T克隆载体上，转化，并将得到的pMD18-T-ALDH重组质粒进行BamHⅠ和SacⅠ双酶切验证(图2)。

将测序正确的pMD18-T-ALDH重组质粒用BamHⅠ和SacⅠ双酶切，回收酶切产物，将回收产物与经BamHⅠ和SacⅠ 双酶切的pET30a(+)表达载体相连，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态和BL21(DE3)感受态细胞，经菌落PCR筛选(图3)后，将筛选得到的阳性单菌落送样测序，得到含有与文献报道的ALDH基因大小一致的E.coliBL21(pET30a-ALDH)重组菌株。

2.2 不同IPTG诱导培养浓度对乙醛脱氢酶活性的影响

挑取转化成功的E.coliBL21(pET30a-ALDH)菌株的少量菌体于LB液体培养基(含30 μg/L卡那霉素)中 37 ℃、180 r/min培养10～12 h至菌液D600 nm值达到0.6～0.9 后，分别加入终浓度为0、0.3、0.5、0.8、1.0 mmol/L的IPTG，然后于28 ℃ 150 r/min条件下诱导培养6 h后，测定诱导产生的ALDH酶蛋白的催化活性，结果如图4所示。以相同条件下培养的E.coliBL21(pET30a)为对照。

从图4中可明显看出，E.coliBL21(pET30a-ALDH)菌株在IPTG诱导浓度增加时，ALDH酶催化的相对活性也在逐步增大，当IPTG诱导浓度为1.0 mmol/L时，ALDH酶催化的相对活性是最高的，可达30.2 U/mL。

本试验中的对照菌株E.coliBL21(pET30a)也检测到了一定的乙醛脱氢酶催化反应活性，说明E.coliBL21(DE3)细胞中是携带有醛脱氢酶基因的，这与其他研究者的研究结果[8，10]是一致的。

2.3 不同诱导时间对乙醛脱氢酶活性的影响

E.coliBL21(pET30a-ALDH)菌株于37 ℃、180 r/min条件下培养至D600 nm值为0.6～0.9后，加入终浓度1.0 mmol/L的IPTG，然后于28 ℃、150 r/min条件下分别诱导培养0、2、4、6、8 h后，测定诱导产生的ALDH酶蛋白的催化活性，测定结果如图5所示。以相同条件下培养的E.coliBL21(pET30a)为对照。

从图5中可明显看出，28 ℃、150 r/min条件下诱导培养时间越长，ALDH酶催化的相对活性越高，诱导培养6 h时，ALDH的相对酶活性达到最高，高达30.2 U/mL，其中，诱导培养2 h之内，ALDH的相对酶活性增长最快；6 h后，随着诱导时间的延长，ALDH的相对酶活性反而有所下降，其原因可能是ALDH酶活性半衰期较短，当诱导时间较长时，诱导表达的ALDH酶蛋白部分被降解或失活。

2.4 不同诱导温度对乙醛脱氢酶活性的影响

E.coliBL21(pET30a-ALDH)菌株于37 ℃、180 r/min条件下培养至D600 nm值为0.6～0.9后，加入终浓度1.0 mmol/L的IPTG，分别于28 ℃、150 r/min和37 ℃、150 r/min条件下诱导培养6 h后测定诱导产生的ALDH的酶催化活性。分析发现，当诱导温度为28 ℃时，ALDH酶的相对活性明显高于诱导温度为37 ℃时的相对活性(图6)，其原因可能是诱导温度升高时，产生的包涵体增多，使得可溶性的ALDH浓度降低，或者ALDH酶对温度很敏感，高温使部分酶失活或钝化了。

3 结论

本试验首先通过PCR技术从酿酒酵母基因组DNA中克隆得到长度约1.6 kb的乙醛脱氢酶基因的ORF序列，并将其连入pET30a(+)表达载体中，成功构建了酿酒酵母乙醛脱氢酶基因的原核表达载体；同时对构建的酿酒酵母乙醛脱氢酶基因的原核表达载体在宿主细胞大肠杆菌BL21(DE3)中的诱导表达条件进行筛选，发现诱导表达的乙醛脱氢酶催化活性受到诱导物IPTG浓度、诱导表达时间和诱导温度的影响，当IPTG浓度为1.0 mmol/L、诱导时间为6 h、诱导温度为 28 ℃ 时，诱导表达出的乙醛脱氢酶相对酶活性最高，可达30.2 U/mL。目前本课题组正在对酿酒酵母ALDH基因进行突变试验，期望能得到活性更高、耐适性更好的ALDH酶，以提高微生物发酵生产3-HP的效率。

参考文献：

[1]Gregory G L，López-Vidal E M，Buchard A. Polymers from sugars：cyclic monomer synthesis，ring-opening polymerisation，material properties and applications[J]. Chemical Communications，2017，53(14)：2198-2217.

[2]张鸿达，刘 成，高卫华，等. 微生物发酵法生产3-羟基丙酸的研究进展[J]. 化工进展，2007，26(1)：33-36.

[3]楼 坚，裘娟萍. 生物法合成3-羟基丙酸的研究进展[J]. 工业微生物，2006，36(4)：56-60.

[4]李 鑫，毛跟年. 乙醛脱氢酶提取工艺与活性研究[D]. 西安：陕西科技大学，2011.

[5]黄 瑞，王 璐，沈 微，等. 酿酒酵母乙醛脱氢酶的克隆与表达[J]. 工业微生物，2009，39(1)：22-27.

[6]邢福国，张培军，谭训刚，等. 酵母基因组的提取[J]. 食品科学，2007，28(3)：210-212.

[7]Lucas S，Copeland A，Lapidus A，et al. Direct Submission[DB]. Walnut Creek：US DOE Joint Genome Institute，2009.

[8]胡 南，缪鑫昕，谈曙明，等. 重组大肠杆菌生物转化甘油生产3-羟基丙酸[J]. 生物技术，2012，22(1)：72-75.

[9]张传丽，陈 鹏. 银杏类黄酮生物合成关键酶基因GbUFGT和GbFOMT的克隆、表达与功能分析[D]. 扬州：扬州大学，2012.

[10]丁月月，朱建国，李 霜. 大肠杆菌醛脱氢酶基因在Klebsiellapneumoniae中的克隆及表达优化[C]//第六届全国化学工程与生物化工年会论文集. 北京：中国化工学会，2010.

[11]赵玉凤，吴元欣. 乙醛脱氢酶基因克隆及酶功能研究[D]. 武汉：华中农业大学，2009.