半胱氨酸保护基S-Phenylacetamidomethyl (Phacm)的合成及应用

黄 蓓，刘秀伟，袁 琳，罗迎娣，刘 毅

(河南省化工研究所有限责任公司，河南 郑州 450052)

多肽固相合成中侧链上半胱氨酸的巯基必须要预先被保护基保护起来，否则其高亲核性的巯基将有可能在接肽过程中发生酰基化、烷基化等副反应[1]。

由半胱氨酸形成的二硫键在许多蛋白质和多肽中是一类非常重要的结构元素。来自不同物种的各种各样的肽荷尔蒙、蛋白酶抑制剂、细胞激素和毒素都携带有此二硫键的结构元素，以便形成理想的三维结构以及赋予直链肽生物活性。为了使这些含有独特二硫键结构的多肽和蛋白类物质能被作为潜在药物候选者且最终真正应用到实际治疗疾病过程中，大量的研究和优化工作已经开展[2]。

单个分子内的二硫键多肽分子的构建，常规的方法都是在反应最后一步溶液 中氧化相应的半胱氨酸的自由巯基。然而，当在多肽分子中构建多个二硫键时将会遇到一个巨大的挑战，即如何能保证做到按照分子设计的那样清晰明了地构建相应的二硫键，同时还可以高收率的得到目标产物。为了解决这个问题就需要在肽链合成中选择合适的保护基对不同位点的半胱氨酸进行正交保护，通过不同的脱除条件来分步实现相应位点二硫键的构建，最终得到设计的目标产物[3]。

图1 Phacm 保护基结构

传统的半胱氨酸巯基保护基尽管可以构建大多数的多个二硫键，但是其相应的保护基脱除都需要在相对比较苛刻的化学条件下实现，如强酸、重金属等。本文介绍了一种近年来发展起来的利用生物酶在非常温和条件下就可以脱除的巯基保护基：S-Phenylacetamidomethyl(Phacm)，Phacm 保护基结构如图1所示[4]。

1 S-Phenylacetamidomethyl(Phacm)介绍

S-Phenylacetamidomethyl(Phacm)是一种半胱氨酸巯基保护基，此保护基可以兼容传统的两种多肽合成策略(Boc和Fmoc)。

Phacm与Acm在分子结构上有很大的相似性，因此这两类保护基在化学性质上有一定的共通性，例如在标准的多肽合成过程中，这两类保护基对相应的缩合剂和反应溶剂耐受性都很好。此外，Acm的脱除条件也可以被用于脱除Phacm。但另一方面这两类保护基在化学性质上也表现出一定的差异性，例如Phacm可以被PGA生物酶在非常温和的条件下脱除，而PGA生物酶对Acm就没有任何的效果[5]。

2 Phacm保护的半胱氨酸衍生物合成方法

经典的Phacm保护的半胱氨酸衍生物合成过程包含这些步骤：1)苯乙腈酸性条件下水解得到相应苯乙酰胺；2)苯乙酰胺与甲醛在KOH，70℃条件下反应得到相应的胺基被羟甲基取代的N-(羟甲基)-2-苯乙酰胺；3)N-(羟甲基)-2-苯乙酰胺与L-半胱氨酸盐酸盐在三氟甲磺酸-三氟乙酸-水溶剂中，0℃条件下生成巯基被Phacm保护的半胱氨酸三氟甲磺酸盐；4)Phacm保护的半胱氨酸三氟甲磺酸盐再与二碳酸二叔丁酯(Boc2O)或者9-芴甲基-N-琥珀酰亚胺基碳酸酯(Fmoc-OSu)反应最终得到氨基由Boc保护的S-Phacm半胱氨酸衍生物或者氨基由Fmoc保护的S-Phacm半胱氨酸衍生物[6]。Phacm 保护的半胱氨酸衍生物合成方法如图2所示。

图2 Phacm保护的半胱氨酸衍生物合成方法

3 Phacm保护基的脱除

为了得到活性目标分子，任何的保护基最终都要被脱除。Phacm作为巯基保护基也是如此，为了最终得到活性目标多肽分子，保护基Phacm也要最终被从分子结构中脱除。

以上介绍了Phacm保护基可以被PGA活性酶在非常温和的条件下专一性的脱去，并且基本不会引起其它的副反应发生。近年来为了更方便地使用和回收PGA活性酶，已经发展了一种将PGA固载在高分子树脂上的技术，这种固载的PGA活性酶不仅可以高效地脱除Phacm保护基，而且也可以很方便的回收，经多次利用后仍然具有高效的脱除活性[5]。

Phacm保护基被PGA活性酶脱除的机理：PGA活性酶可以在非常温和的条件下专一性地脱除Phacm保护基骨架中的苯乙酰基并分解出苯乙酸，剩下的胺甲基保护的巯基进一步水解后，最终游离出含有自由巯基的半胱氨酸的活性肽[7]。PGA脱除Phacm保护基的机理如图3所示。

图3 PGA脱除Phacm保护基的机理

4 Phacm保护基的兼容性和应用

研究表明Phacm保护的半胱氨酸(Cys(Phacm))在两种传统的多肽固相合成策略中(Boc和Fmoc)在常用的肽链偶联反应条件下，如DIEA-CH2Cl2(1∶19)、TFA- CH2Cl2(4∶6)、piperidine-DMF (2∶8)、0.1mol/L TBAF 的DMF溶液和DBU-DMF (1∶19)，室温25℃反应24 h后仍然十分稳定，没有发现任何的分解或者被脱除情况发生。

另外，研究也证明Phacm保护的半胱氨酸 (Cys(Phacm)) 在HF-Anisole 或 p-Cresol (9∶1) 0℃条件下反应1 h，以及TFA-Scavengers (Phenol,Ethane-1,2-dithiol,p-Cresol,Anisole) 室温25℃反应2h，这两种多肽合成策略中最后脱除全部保护基的条件下也是相对稳定的。同时，进一步地研究发现Phacm保护的半胱氨酸 (Cys(Phacm)) 即使在脱除巯基保护基Fm的条件下(Piperidine-DMF-β-mercaptoethanol (βME) = 10∶10∶0.7)也是非常稳定的[8]。

基于以上的研究数据显示，巯基保护基Phacm可以在多肽合成中在脱除所有侧链保护基的条件下保留下来，这就给下一步形成不同二硫键提供了一个很好的区位选择可能性。

由于Phacm保护基这些独特的性质，此保护基已经在尾加压素类多肽(Urotensin-related peptide)和催产素类物质 (Oxytocin analogue) 等其他含有二硫键多肽类药物的合成中取得了很好的效果[9]。

5 结论及展望

随着新多肽药物的发现和多肽技术的不断更新，构建更加复杂多变的分子骨架的需求将会逐渐增加，这就相应的要求各种类型的保护基的发现与发展。近年来，随着各个学科的不断交叉融合，多肽药物的合成也逐渐出现了与小分子、高分子、聚合物等物质结构和学科的融合，特别是对合成含有多个二硫键的多肽药物，对半胱氨酸保护基的正交选择尤为重要。因此寻找、发现、发展更加性质独特或者广谱性的半胱氨酸保护基也始终是多肽药物合成研究的重点之一。

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[9]Chatenet D,Dubessy C,Leprince J,et al.Structure-activity relationships and structural conformation of a novel urotensin II-related original research article[J].Peptides,2004,25(10):1819-1830.

(本文文献格式：黄蓓，刘秀伟，袁琳，等.半胱氨酸保护基S-Phenylacetamidomethyl (Phacm)的合成及应用[J].山东化工,2018,47(7):51-53.)